摘要：利用H2O2建立延邊黃牛耳成纖維細胞氧化損傷模型，在耳成纖維細胞培養(yǎng)液中分別添加不同濃度的小蘗堿、川芎嗪和淫羊藿苷培養(yǎng)24、48、72和96 h，對延邊黃牛耳成纖維細胞氧化損傷進行修復。結果表明，1 μmol/L小蘗堿、50 μg/mL川芎嗪及0.001 μg/mL淫羊藿苷培養(yǎng)72 h后細胞活力均顯著高于對照組，其對氧化損傷的修復作用顯著高于自我修復組。

關鍵詞：小蘗堿；川芎嗪；淫羊藿苷；延邊黃牛；耳成纖維細胞；氧化修復

中圖分類號：Q813.1+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）02-0381-03

延邊黃牛是我國的珍貴家畜品種之一，具有優(yōu)良的品種特征和肉品特性。在延邊黃牛體細胞克隆中，氧化損傷是不可忽略的因素。以往研究者主要針對卵母細胞和胚胎抗氧化方面進行了很多研究。韓巖等[1]研究表明添加一些抗氧化劑可以降低ROS對卵母細胞IVM發(fā)育過程中的損傷，提高卵母細胞IVM的效率，例如1.0 mmol/L的谷氨酰胺能夠顯著提高卵母細胞的成熟率，同時也能提高囊胚率，表明谷氨酰胺能夠提高延邊黃牛卵母細胞的體外成熟率，并能促進囊胚發(fā)育。

中藥是中華民族五千年文化的瑰寶，小蘗堿、川芎嗪及淫羊藿苷在抑制癌細胞生長及抗氧化中發(fā)揮著重要的作用。該研究通過在延邊黃牛耳成纖維細胞培養(yǎng)液中添加小蘗堿、川芎嗪和淫羊藿苷，提高延邊黃牛耳成纖維細胞的細胞活力，以增強其對氧化損傷的修復能力，以期提高核供體的質(zhì)量和克隆效果。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)液、30%H2O2、EDTA、胰蛋白酶、MTT、二甲基亞砜、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉及Hoechst 33342均購自Sigma公司；新生胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；小蘗堿、川芎嗪和淫羊藿苷由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 方法

1.2.1 延邊黃牛耳成纖維細胞的培養(yǎng) 耳組織塊剪切1 mm3左右的小塊，加入等體積的0.25%胰蛋白酶，4 ℃消化過夜，將消化下來的液體接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后換液。待細胞生長至85%以上，用0.25%胰蛋白酶消化，然后按1∶3進行細胞傳代。

1.2.2 用小蘗堿、川芎嗪和淫羊藿苷處理細胞檢測其對細胞活力的影響 將生長至85%左右的第五代耳成纖維細胞以0.25%胰蛋白酶消化，然后用10%血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，細胞計數(shù)后以1.5×105 ～2×105 個細胞的密度接種于96孔板，每孔補培養(yǎng)液至200 μL，培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)液，分別加入10、1、0.1、0.01μmol/L的小蘗堿，100、50、25 μg/mL川芎嗪和1、0.1、0.01、0.001 μg/mL的淫羊藿苷各200 μL，培養(yǎng)24、48、72和96 h。空白對照中的細胞添加10%血清的培養(yǎng)液，用MTT法測定細胞在波長492 nm處的吸光值，篩選出最適濃度和時間。每個濃度重復4次，試驗重復3次。

1.2.3 氧化損傷細胞模型的建立 細胞按照“1.2.2”方法鋪板后，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，添加0.5 mmol/L H2O2培養(yǎng)液，再放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min。

1.2.4 氧化損傷細胞活力的測定 細胞加入0.5 mmol/L H2O2的培養(yǎng)液培養(yǎng)30 min后，用MTT法測定細胞在波長492 nm處的吸光值。

1.2.5 自我氧化修復細胞活力的測定 細胞按照“1.2.2”方法鋪板后，加入0.5 mmol/L H2O2的培養(yǎng)液培養(yǎng)30 min后，吸去氧化損傷細胞的培養(yǎng)液，加入適量DMEM培養(yǎng)液洗3遍，將孔內(nèi)H2O2的培養(yǎng)液洗干凈，再添加200 μL 10%血清的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。培養(yǎng)到待測時間后，用MTT法測定細胞在波長492 nm處的吸光值。

1.2.6 小蘗堿、川芎嗪和淫羊藿苷氧化修復后細胞活力的測定 細胞按照“1.2.2”方法鋪板后，加入0.5 mmol/L H2O2的培養(yǎng)液培養(yǎng)30 min后，吸去氧化損傷細胞的培養(yǎng)液，加入適量DMEM培養(yǎng)液洗3遍，將孔內(nèi)H2O2的培養(yǎng)液洗干凈，再添加含有最適濃度中藥的10%血清的DMEM培養(yǎng)液200 μL進行培養(yǎng)，培養(yǎng)到篩選出的時間后，用MTT法測定細胞在波長492 nm處的吸光值。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 小蘗堿對延邊黃牛耳成纖維細胞的影響

測定了培養(yǎng)液中添加0、0.01、0.1、1、10 μmol/L 5種濃度的小蘗堿對延邊黃牛耳成纖維細胞活力的影響（表1）。由表1可知，小蘗堿在0.01～1 μmol/L濃度范圍內(nèi)均能提高延邊黃牛耳成纖維細胞活力，1 μmol/L小蘗堿培養(yǎng)72 h后的耳成纖維細胞活力顯著高于對照組。

2.2 川芎嗪對延邊黃牛耳成纖維細胞的影響

測定了培養(yǎng)液中分別添加0、25、50、100 μg/mL 4種濃度的川芎嗪對延邊黃牛耳成纖維細胞活力的影響（表2）。由表2可知，川芎嗪在25～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)均能提高延邊黃牛耳成纖維細胞活力。其中，50 μg/mL川芎嗪培養(yǎng)72 h后細胞活力均顯著高于對照組。

2.3 淫羊藿苷對延邊黃牛耳成纖維細胞的影響

測定了培養(yǎng)液中添加0、0.001、0.01、0.1、1 μg/mL 5種濃度的淫羊藿苷對延邊黃牛耳成纖維細胞活力的影響（表3）。由表3可知，淫羊藿苷組均能提高延邊黃牛耳成纖維細胞活力。淫羊藿苷在0.001～0.1 μg/mL濃度范圍內(nèi)細胞培養(yǎng)72 h后，細胞活力均顯著高于對照組。其中，濃度為0.001 μg/mL淫羊藿苷培養(yǎng)72 h提高細胞活力效果最好。

2.4 小蘗堿、川芎嗪和淫羊藿苷對延邊黃牛耳成纖維細胞的氧化修復作用

小蘗堿對延邊黃牛耳成纖維細胞的氧化修復作用見表4。由表4可知，0.5 mmol/L H2O2能夠抑制延邊黃牛耳成纖維細胞生長，1 μmol/L小蘗堿培養(yǎng)72 h后的細胞活力比自我修復組和對照組高且差異性顯著，表明小蘗堿能夠有效地修復延邊黃牛耳成纖維細胞的氧化損傷。

川芎嗪對延邊黃牛耳成纖維細胞的氧化修復作用見表4。由表4可見，0.5 mmol/L H2O2能夠抑制延邊黃牛耳成纖維細胞生長，50 μg/mL川芎嗪培養(yǎng)72 h后細胞活力比自我修復組和對照組高且差異性顯著，表明川芎嗪能夠有效地修復延邊黃牛耳成纖維細胞的氧化損傷。

淫羊藿對延邊黃牛耳成纖維細胞的氧化修復作用見表4。由表4可見，0.5 mmol/L H2O2能夠抑制延邊黃牛耳成纖維細胞生長，0.001 μg/mL淫羊藿苷培養(yǎng)72 h后細胞活力比自我修復組和對照組高且差異性顯著，表明淫羊藿苷能夠有效地修復延邊黃牛耳成纖維細胞的氧化損傷。

3 小結與討論

中藥成分在胚胎發(fā)育方面的抗氧化作用逐漸引起人們的注意。李玉芳等[2]證實肉蓯蓉和黃芪均能夠顯著促進早期胚胎發(fā)育。張建芳等[3]也證實了黃芪多糖能提高體外受精胚胎發(fā)育率和孵化率。小劑量的淫羊藿苷能明顯促進豬體外孤雌激活胚胎的發(fā)育。中藥成分促進胚胎發(fā)育與它在一定程度上清除氧自由基有關[4]。

在核移植實驗中，將活力好的細胞冷凍供核前解凍。延邊黃牛耳成纖維細胞雖然是體細胞核移植中的供體細胞，但是對其細胞特性的研究較少，在培養(yǎng)的過程中細胞老化是一個很嚴重的問題。在冷凍、解凍和消化等操作中，細胞會不可避免地暴露在比體內(nèi)氧濃度高的環(huán)境中，因此會受到氧化應激的損傷，并且隨著細胞的傳代，細胞逐漸衰老，抵抗氧化損傷以及修復的能力逐漸下降。

該試驗在體外研究了最佳濃度的淫羊藿苷、小蘗堿和川芎嗪對氧化損傷的延邊黃牛耳成纖維細胞的修復能力的影響。結果表明，淫羊藿苷、小蘗堿和川芎嗪能對氧化損傷的延邊黃牛耳成纖維細胞的修復能力比自我修復能力顯著增高。因此，小蘗堿、川芎嗪和淫羊藿苷具有較好的氧化修復能力，對細胞起到保護作用。

參考文獻：

[1] 韓 巖，莊利利，王玉涵，等.谷氨酰胺對延邊黃牛卵母細胞成熟及重組胚發(fā)育的影響[J].畜牧與獸醫(yī)，2010，42（5）：11-14.

[2] 李玉芳，徐芹偉，張 麗，等.中草藥肉蓯蓉和黃芪對豬早期胚胎體外發(fā)育的影響[J].江西農(nóng)業(yè)大學學報，2007，29（5）：805-807.

[3] 張建芳，高建明，陳 武，等.黃芪多糖對小鼠1-細胞胚胎體外發(fā)育效果的初步研究[J].中國比較醫(yī)學雜志，2007，17（16）：333-337.

[4] 徐 捷，李冬冬，張志剛，等.3種中藥單體成分對豬孤雌激活胚胎體外發(fā)育效果的影響[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009，36（3）：112-115.