摘要：采用富集培養(yǎng)法從污水處理廠濃縮污泥中獲得一株能夠高效降解苯胺的菌株AD-3，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得到苯胺降解最佳條件為溫度30 ℃、初始pH 7.0、培養(yǎng)時(shí)間48 h和苯胺最大耐受濃度2 500 mg/L，此時(shí)的苯胺降解率達(dá)99.7%；重金屬離子對(duì)該菌株降解苯胺有一定的抑制作用，其中Ag+和Hg2+的抑制作用較明顯。

關(guān)鍵詞：苯胺；降解菌；篩選；降解特性

中圖分類號(hào)：X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）02-0316-03

苯胺是染料、橡膠、塑料和制藥工業(yè)的重要原料，一些偶氮染料在環(huán)境中經(jīng)微生物還原后也可形成苯胺。苯胺毒性大、難降解，可以引起人和動(dòng)物溶血性貧血，中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及其他臟器的損害，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，因此苯胺是嚴(yán)重污染環(huán)境和危害人體健康的有害物質(zhì)[1]。生物降解是消除環(huán)境中苯胺的一種經(jīng)濟(jì)有效且無二次污染的方法。目前，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者對(duì)苯胺降解菌開展了大量的研究工作，已篩選到多種高效降解菌，如假單胞桿菌、芽孢桿菌、節(jié)桿菌等[2-4]，但仍存在著降解速度慢、處理濃度低等弊端，因此篩選能快速降解高濃度苯胺的降解菌勢(shì)在必行。該試驗(yàn)以從污水處理廠的濃縮污泥中篩選出的一株能夠以苯胺為惟一碳源、氮源的高效降解菌株為研究對(duì)象，對(duì)其降解特性進(jìn)行了分析，旨在為污水處理廠處理廢水及該菌的污泥培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 污泥來源 試驗(yàn)用活性污泥取自唐山某生活污水處理廠污泥濃縮車間。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）富集培養(yǎng)基。蛋白胨 1.0 g、葡萄糖 5.0 g、K2HPO4 1.0 g、KH2PO4 1.0 g、NaCl 5.0 g、苯胺 0.1 g、瓊脂粉20.0 g，加水至1 000 mL，pH 7.0～7.2。

2）篩選培養(yǎng)基。K2HPO4 0.5 g、KH2PO4 0.5 g、NaCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCl2 0.1 g、MnSO4·H2O 0.15 g、FeCl2 0.3 g、NH4NO3 1.0 g、苯胺0.1 g，加水至1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.3 主要儀器 恒溫?fù)u床（HQ45）：中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；高速離心機(jī)（LG15-W） ：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9082）：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；722N可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離篩選 將少量活性污泥接種于裝有富集培養(yǎng)基的三角瓶中，進(jìn)行馴化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min。將培養(yǎng)液按梯度稀釋分離法涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，待其長(zhǎng)出單菌落后觀察菌落形態(tài)。

1.2.2 苯胺降解率的測(cè)定 用N-（1-萘基）乙二胺偶氮分光光度法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定苯胺濃度[5]，以苯胺降解率表示菌株對(duì)苯胺的降解能力。

1.2.3 環(huán)境因素對(duì)菌株降解苯胺的影響 選取苯胺降解率最高的一株菌株AD-3用作降解菌株，分別研究溫度、pH、培養(yǎng)時(shí)間和苯胺濃度對(duì)苯胺降解的影響，通過正交試驗(yàn)進(jìn)行最佳苯胺降解條件的優(yōu)化，同時(shí)探討重金屬離子對(duì)菌株降解苯胺的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離和篩選結(jié)果

經(jīng)劃線分離得到的苯胺高效降解菌菌株AD-3菌落為半透明、圓形、邊緣整齊、隆起或微隆起、表面光滑、淡黃色、微光澤。

2.2 苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以苯胺含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。當(dāng)苯胺的濃度為0～40 mg/L時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為■=0.026 6x-0.014 0（r2=0.999 5）。

2.3 環(huán)境因素對(duì)菌株降解苯胺的影響

2.3.1 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株降解苯胺的影響 將篩選到的高效苯胺降解菌菌株AD-3接種到含有2 000 mg/L苯胺、初始pH 7.0的液體培養(yǎng)基中，在不同溫度（20、25、30、35和40 ℃）下振蕩培養(yǎng)48 h，計(jì)算苯胺降解率。由圖2可知，AD-3菌株降解苯胺的適應(yīng)溫度范圍為25～35 ℃，在30 ℃時(shí)苯胺的降解率最高。

2.3.2 初始pH對(duì)菌株降解苯胺的影響 將篩選到的高效苯胺降解菌菌株AD-3接種到含有2 000 mg/L苯胺、不同初始pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，計(jì)算苯胺降解率。由圖3可知，AD-3菌株對(duì)苯胺降解的pH范圍較窄，其最佳pH 7.0。

2.3.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株降解苯胺的影響 將篩選到的高效苯胺降解菌菌株AD-3接種到含有2 000 mg/L苯胺、初始pH 7.0的液體培養(yǎng)基中，在30 ℃下振蕩培養(yǎng)不同的時(shí)間（12、24、36、48、60、72 h），計(jì)算苯胺降解率。由圖4可知，培養(yǎng)時(shí)間為48 h苯胺的降解率最高。

2.3.4 苯胺濃度對(duì)菌株降解苯胺的影響 將篩選到的高效苯胺降解菌菌株AD-3接種到苯胺濃度分別為500、1 000、1 500、2 000、2 500和3 000 mg/L，初始pH 7.0的液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，計(jì)算苯胺降解率。由圖5可知，當(dāng)苯胺為2 500 mg/L時(shí)，苯胺的降解率達(dá)到99.2%。隨著苯胺濃度進(jìn)一步提高，苯胺降解率下降，分析原因可能是高濃度的苯胺抑制菌株生長(zhǎng)。

2.4 提高苯胺降解率的菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，考慮培養(yǎng)溫度、初始pH、培養(yǎng)時(shí)間和苯胺濃度對(duì)苯胺降解率的綜合影響， 按L9（34）正交表安排試驗(yàn)，進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化，各因素所取水平如表1所示，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。從表2直觀分析可以看出，各因素對(duì)苯胺降解率的影響為A>C>B>D。由方差分析可知，溫度對(duì)苯胺降解率影響顯著，而苯胺濃度、初始pH和培養(yǎng)時(shí)間影響不顯著，和直觀分析結(jié)果一致。確定最佳的苯胺降解條件為培養(yǎng)溫度30 ℃、初始pH 7.0、培養(yǎng)時(shí)間48 h和苯胺濃度2 500 mg/L。在最佳苯胺降解條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，苯胺降解率分別為99.6%、99.9%、99.8%，苯胺平均降解率為99.7%，表明該菌株降解苯胺的效率較高。

2.5 重金屬離子對(duì)菌株降解苯胺的影響

在含有2 500 mg/L苯胺的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別添加Cu2+（1.00 mmol/L）、Ag+（0.01 mmol/L）、Hg2+（0.02 mmol/L）、Pb2+（0.50 mmol/L）4種重金屬離子，并以未添加重金屬離子的處理為對(duì)照，在相同培養(yǎng)條件下考查4種重金屬離子對(duì)苯胺降解率的影響。結(jié)果（圖6）表明，供試濃度的4種重金屬離子對(duì)苯胺的降解均有抑制作用，其中， Ag+抑制作用最明顯，苯胺降解率僅為30%，其次是Hg2+，再次是Pb2+，Cu2+抑制作用最小。

3 結(jié)論

研究獲得了一株高效苯胺降解菌菌株AD-3，該菌株培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，能夠以苯胺為惟一碳源和氮源生長(zhǎng)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得到菌株降解苯胺的最佳條件為培養(yǎng)溫度30 ℃、初始pH 7.0、培養(yǎng)時(shí)間48 h和苯胺濃度2 500 mg/L，此時(shí)苯胺降解率達(dá)99.7%，表明該菌株降解苯胺的效率較高；同時(shí)探討了重金屬離子對(duì)菌株降解苯胺的影響，結(jié)果表明，4種重金屬離子對(duì)苯胺的降解均有抑制作用，其中， Ag+和 Hg2+抑制作用較明顯，其次是Pb2+，Cu2+的抑制作用最小。

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