摘要：采用稀釋平板法，利用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，首次對茯磚茶發(fā)源地陜西省生產(chǎn)的茯磚茶中的“金花”菌進行了鑒定研究。通過分離純化，獲得了菌株JW0；通過菌落特征和形態(tài)學觀察及回接陜南曬青毛茶，確認該菌株為子囊菌綱、曲霉目、曲霉科、散囊菌屬、冠突散囊菌；其無性型為小冠曲霉，異名冠突曲霉、針刺曲霉。

關(guān)鍵詞：茯磚茶；冠突散囊菌；分離；回接；陜西省

中圖分類號：TS272.5+4；Q949.327.1；Q93-331（241） 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）02-0345-04

中國茯磚茶生產(chǎn)歷史悠久，因其具有神秘“金花”（金黃色的菌體）而備受關(guān)注?！敖鸹ā笔擒虼u茶在特定溫度、濕度條件下，通過“發(fā)花”工藝長成的自然益生菌體，民間俗稱“金花”。該茶最初是由湖南省所產(chǎn)的黑毛茶運往陜西省涇陽市筑制茯磚而成，早期稱“湖茶”；因在夏季伏天加工，故又稱“伏茶”。該茶于20世紀50年代轉(zhuǎn)產(chǎn)于湖南省，80年代湖北省也開始生產(chǎn)；目前有關(guān)“金花”菌的分離、鑒定、生理特性、功能特性以及與茯磚茶品質(zhì)形成的關(guān)系等[1-3]方面的研究，多以湖南、湖北等省生產(chǎn)的茯磚茶為研究對象，而關(guān)于茯磚茶發(fā)源地陜西省茯磚茶中的“金花”菌研究鮮有報道。試驗采用稀釋平板法從來自陜西省生產(chǎn)的茯磚茶中分離出“金花”菌——冠突散囊菌 [Eurotium cristatum（Raper Fennell）Malloch Cain]，并對其進行了回接試驗和形態(tài)學鑒定，以期為進一步研究和優(yōu)化茯磚茶生產(chǎn)技術(shù)提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品為含有“金花”的茯茶磚，毛茶為陜南曬青毛茶，均由陜西省咸陽市涇渭茯茶有限公司提供。供試培養(yǎng)基一類是分離純化培養(yǎng)基，有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；另一類是形態(tài)鑒定培養(yǎng)基，包括察氏瓊脂培養(yǎng)基（CZ）、20%蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基、40%蔗糖麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 “金花”菌的分離純化 參照楊撫林[4]的研究方法，先將茶磚用粉碎機磨碎，過80目篩，篩底用于菌種分離。稱取10 g 篩底樣品，放入帶有玻璃珠的250 mL三角瓶中（內(nèi)裝90 mL去離子水），置恒溫搖床上200 r/min振蕩30 min，得到的混懸液即為母液。從母液中吸取5 mL 上清液，加入到45 mL去離子水中，依次進行10倍遞增稀釋，制成10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%稀釋液。選取適宜的相連3個梯度，吸取0.1 mL 混懸液加入已備好的PDA平板培養(yǎng)基上，用無菌玻璃棒涂布均勻，每一稀釋濃度做3個重復，并以去離子水做空白對照。將平板倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)4 d后，用接種環(huán)挑取單菌落的黃色閉囊殼在空白PDA平板上劃線，經(jīng)過這樣2～3次劃線培養(yǎng)就可獲得該“金花”菌的純培養(yǎng)，最后轉(zhuǎn)接于PDA斜面試管中，于28 ℃培養(yǎng)5 d后，4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 “金花”菌的形態(tài)學鑒定 采用平板培養(yǎng)法，將純化后的菌株接種于直徑9 cm、加有CZ培養(yǎng)基和20%蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基及40%蔗糖麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，于28 ℃暗室培養(yǎng)，每天觀察菌落形態(tài)，測量菌落直徑。挑取菌絲及黃色閉囊殼在顯微鏡下觀察和照相。菌種鑒定參照文獻[5]的方法。

1.2.3 回接毛茶 參照文獻[6]的方法將陜南曬青毛茶剪成長度約1 cm的小段，稱取30 g放入500 mL三角瓶中，加入去離子水10 mL，振蕩混勻放置1 h后，于121 ℃滅菌20 min，冷卻后將含有“金花”菌子囊孢子的無菌水均勻灑入已滅菌的陜南曬青毛茶中，接入濃度為1×106～10×106個/mL的孢子混懸液1 mL，對照不接菌。置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察茶樣變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 “金花”菌的菌落形態(tài)及培養(yǎng)性狀

經(jīng)過分離純化，從含有“金花”菌的茯磚茶中分離獲得了一株產(chǎn)黃色閉囊殼的菌株，菌株編號為JW0。該菌株的菌落在CZ培養(yǎng)基上生長緩慢，菌落形態(tài)特征如圖1-A所示。在28 ℃條件下培養(yǎng)7 d菌落直徑可達31 mm，培養(yǎng)14 d達64 mm；菌落周邊黃色，中心部分顏色較深，近于橄欖褐色至丁香褐色；具飾菌絲黃色，老化后變成褐色；菌落中央呈現(xiàn)少量灰褐色的滲出物，未見分生孢子結(jié)構(gòu)；色素擴散于基質(zhì)中，菌落周圍和反面呈黑褐色。

菌落在20%蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基上生長較快，28 ℃條件下培養(yǎng)7 d菌落直徑可達55 mm、培養(yǎng)12 d長滿平皿；中央菌落呈肉桂淺黃色至灰色，邊緣黃色，菌落表面呈現(xiàn)簇狀菌絲形態(tài)，分泌色素減少，培養(yǎng)基顏色比在CZ培養(yǎng)基上的淺，邊緣可見分生孢子結(jié)構(gòu)。

菌落在40%蔗糖麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長很快，28 ℃條件下培養(yǎng)6 d即可長滿平皿；菌落黃色，菌落中央和邊緣顏色相差不大，菌落邊緣有稀疏的分生孢子結(jié)構(gòu)，菌落反面黃色。

2.2 “金花”菌的顯微形態(tài)特征

顯微觀察可見JW0菌絲體無色，沒有分支，具隔膜；閉囊殼黃色，呈球形或近球形，成熟較快，直徑82～180 μm，處于具飾菌絲網(wǎng)中（圖1-B）；閉囊殼中含有大量子囊，子囊球形或近球形，大小為10～14 μm，每個子囊含有8個子囊孢子（圖1-C）；子囊孢子呈雙凸鏡形，表面不光滑，孢子體大小為5～6 μm×4～5 μm（圖1-D）。分生孢子頭呈灰綠色，幼時球形，直徑37～75 μm，成熟后呈疏松放射狀；分生孢子梗壁光滑，梗莖長125～300 μm、粗5～9 μm（圖1-E）；頂囊球形或燒瓶形，直徑20～30 μm；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層，瓶梗直接生于頂囊上，大小為6.4～9.6 μm×2.4～3.2 μm，瓶梗成熟后分生孢子從瓶梗頂端以出芽方式發(fā)育（圖1-F，圖1-G），分生孢子呈球形或橢圓形，壁粗糙，大小為4.0 ～4.8 μm×3.2～4.0 μm。隨著分生孢子的成熟，其下端的另一個分生孢子在瓶梗頂端開始發(fā)育，將其向外頂出，從而使分生孢子串生在瓶梗頂端，有些孢子單個脫落，而有些孢子則成串脫落（圖1-H），可見明顯的孢間聯(lián)體。

2.3 “金花”菌回接毛茶試驗

經(jīng)接入菌株JW0的陜南曬青毛茶培養(yǎng)5 d后，茶葉表面長出白色菌絲，與瓶壁接觸部位出現(xiàn)黃色粉末狀物質(zhì)；培養(yǎng)7 d后，茶葉表面長出大量的黃色顆粒狀物質(zhì)（圖2-A，圖2-B），與瓶底和瓶壁接觸部位的顆粒較大，形態(tài)顏色與茯磚茶中的“金花”菌相同（圖2-C）。挑取黃色顆粒進行顯微觀察，其形態(tài)特征與已發(fā)花的茯磚茶中的“金花”菌相同。

經(jīng)形態(tài)學鑒定和回接試驗，參照文獻[5]的方法并結(jié)合溫瓊英[7]和彭曉赟等[8]的研究結(jié)果，將菌株JW0鑒定為冠突散囊菌[Eurotium cristatum （Raper Fennell） Malloch Cain]，屬子囊菌綱（Ascomycetes）、曲霉目（Eurotiales）、曲霉科（Eurotiaceae）、散囊菌屬（Eurotium Link Fr.）。其無性型為小冠曲霉（Aspergillus cristatellus Kozak.） ，異名冠突曲霉（A. cristatus Raper Fennell）、針刺曲霉（A. spiculosus Blaser）。

3 討論

冠突散囊菌在我國分布普遍，是茯磚茶發(fā)酵的優(yōu)勢菌[7]。試驗首次對陜西省生產(chǎn)的茯磚茶中的益生菌進行分離鑒定，得到了一株菌株JW0，其菌落形態(tài)和光學顯微特征與文獻[9]、文獻[10]描述的特征相同。為進一步驗證所分離的菌株是否就是茯磚茶中的“金花”菌，又將分離菌株接種在當?shù)厣a(chǎn)的陜南曬青毛茶中，結(jié)果表明所分離的菌株的確為冠突散囊菌。

冠突散囊菌在CZ培養(yǎng)基上生長緩慢，在20%蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基上生長較快，而在40%蔗糖麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上生長最快，在3種培養(yǎng)基上的生長速度均比文獻[9]測定的結(jié)果快，表明培養(yǎng)溫度為28 ℃時更適宜此菌生長。光學顯微鏡下觀察，冠突散囊菌子囊孢子側(cè)面呈橢圓形，長“赤道”處具有2條明顯的縱向突起的脊，凸面粗糙，正面呈同心圓形，邊緣參差不齊，不光滑，這與溫瓊英[7]、黃浩等[11]研究的結(jié)果相同。分生孢子呈球形或橢圓形，表面有突起，兩端平截，與彭曉赟等[8]研究的結(jié)果相似。該菌在一般條件下進行有性生殖，產(chǎn)生子囊孢子，無論是緊壓的磚茶還是疏松的散茶，發(fā)酵結(jié)束后均可得到黃色的閉囊殼。冠突散囊菌在高溫或者高滲透壓下利于產(chǎn)生分生孢子，一般在35～37 ℃時形成分生孢子較多，當培養(yǎng)基內(nèi)蔗糖含量達到80%以上或者NaCl濃度達到14%以上時，產(chǎn)生大量分生孢子[12]。

試驗將含有冠突散囊菌子囊孢子的無菌水均勻灑入已滅菌的陜南曬青毛茶中，培養(yǎng)7 d后，可觀察到與茯磚茶中形態(tài)顏色相同的“金花”，其顯微形態(tài)特征與原菌株JW0相同，這個結(jié)果表明，陜南曬青毛茶中的“金花”菌與茯磚茶中的“金花”菌實屬同一種微生物——冠突散囊菌，黃浩等[11]的研究也證實了這一點。綜上所述，從陜西省生產(chǎn)的茯磚茶中分離出的菌株的確為冠突散囊菌，其無性型為小冠曲霉（A. cristatellus），異名冠突曲霉（A. cristatus）、針刺曲霉（A. spiculosus）。

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