摘要：對長白山蜂膠的抗氧化、抗疲勞和抑菌能力進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，該蜂膠清除羥基、DPPH和超氧陰離子3種自由基的能力隨其濃度的增大而增強；蜂膠可顯著延長小鼠游泳、爬桿力竭時間，小鼠的肝糖原和肌糖原儲備顯著增加，血乳酸變化幅度很??；蜂膠對細(xì)菌的抑制作用明顯強于真菌，對9種細(xì)菌的最小抑制濃度MIC為25～1 600 μg/mL。長白山蜂膠具有較強的生物活性。

關(guān)鍵詞：蜂膠；生物活性；抗氧化；抗疲勞；抑菌

中圖分類號：S896.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）02-0430-05

蜂膠（Propolis）是由蜜蜂采集植物樹脂、葉芽及傷愈組織分泌物并混入蜂蠟、花粉等經(jīng)咀嚼加工而成的一種黏稠物質(zhì)，蜂膠中含有蜜蜂上顎腺、蠟腺等的分泌物，屬于動植物雙源性物質(zhì)[1]。北溫帶的蜂膠主要來源于楊樹、樺樹和針葉樹等植物的樹脂[2]。蜂膠是蜜蜂用于維持整個群體健康的有效物質(zhì)，是蜜蜂獻(xiàn)給人類的一種最獨特、最神奇的天然物質(zhì)， 被稱為“紫色黃金”。蜂膠是不透明的固體，表面光滑或粗糙，折斷面呈沙粒狀。味微苦，略帶辛辣味，嚼之粘牙，低于15 ℃時變硬、變脆，易粉碎；高于36 ℃時質(zhì)軟，有黏性和可塑性[3]。蜂膠的化學(xué)成分復(fù)雜，目前已發(fā)現(xiàn)200多種組分，主要包括黃酮類、酚醛類、萜類、酯類和有機酸類等，另外還有多種維生素、氨基酸以及鎂、鎘、鐵、鋅、鍶、鈷等微量元素[4]，其中黃酮類化合物達(dá)70多種，是蜂膠質(zhì)量的主要評價依據(jù)。蜂膠味苦、辛，性寒，歸脾、胃經(jīng)。內(nèi)服補虛弱，化濁脂，止消渴；外用解毒消腫，收斂生肌。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)蜂膠具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抑制腫瘤以及雙向調(diào)節(jié)血糖等重要的生理功效[5]。

近年來，隨著生活水平提高，人們保健意識日益增強，具有營養(yǎng)和保健功能的蜂產(chǎn)品越來越受到青睞[6]。本試驗以長白山蜂膠為原料，通過抗氧化、抗疲勞、抑菌等能力的研究，對其生物活性進(jìn)行了分析，以期為長白山蜂膠的開發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

超臨界流體萃取儀（南通華安HA121-50-01）、紫外-可見光度計（島津UV-1700）、高速中藥粉碎機（溫州LG-08A）、空氣振蕩器（哈爾濱HZQ-C）、真空泵（昆山SHB-III）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（步琪R-210）、離心機（江蘇金壇800型）、恒溫干燥箱（上海101-O-BS）、勻漿機（漯河金田JT-B）、超聲波清洗器（昆山KQ3200DB）、恒溫培養(yǎng)箱（上海比朗HWS-150）、冰箱（海爾BCD-215KA）、電子天平（梅特勒 XL-204）。

1.2 原料與試劑

原蜂膠樣品，購于吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH），購于Sigma公司；2，6-二叔丁基對甲酚（BTH）和沒食子酸丙酯（PG）均為食品級，購于河南省所以儀工有限公司肝糖原標(biāo)準(zhǔn)液，肌糖原標(biāo)準(zhǔn)液，尿素氮測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

無水乙醇、三氯甲烷、甲醇、鐵氰化鉀、磷酸、三氯乙酸、雙氧水、硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚、丙酮、乳酸、冰乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉、乙醚、酚酞、氫氧化鉀、氟化鈉等（以上試劑均為分析純）。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、蠟樣芽胞桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、普通變形桿菌、產(chǎn)氣桿菌、啤酒酵母、假絲酵母、黑曲霉（以上菌種、培養(yǎng)基均由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院微生物研究室提供）。

試驗動物：昆明種雄性小鼠6～8周齡，體重18～22 g，由吉林正業(yè)生物制品有限公司動物室提供。

1.3 方法

1.3.1 蜂膠萃取液的制備 將原蜂膠樣品冷凍、粉碎后，取50.0 g，加入10.0 g滑石粉混合均勻后裝入萃取斧中，以體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇作為夾帶劑，采用超臨界CO2流體萃取法萃取蜂膠。其中萃取溫度為40 ℃，萃取壓力為30 MPa；分離1壓力為8 MPa，溫度為45 ℃；分離2壓力為6 MPa，溫度為40 ℃。循環(huán)萃取，間隔30 min，從分離1中取萃取物至無。

1.3.2 清除自由基能力的測定 取2.5 mL 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μg/mL蜂膠萃取物乙醇液、BHT 和PG 乙醇溶液，加入0.2 mol/L pH6.6磷酸緩沖溶液2.5 mL及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀2.5 mL，50 ℃水浴20 min后急速冷卻，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液2.5 mL 3 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL，加蒸餾水4 mL及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3 1 mL 混勻放置10 min，于700 nm處測定吸光值。

1.3.3 羥基自由基清除率的測定 分別于6個10 mL容量瓶中加入9 mmol/L FeSO4 2 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇2 mL、0～150.0 μg/mL上述蜂膠提取液2 mL后，加8.8 mmol/L H2O2 2 mL，37 ℃水浴0.5 h，以去離子水為對照溶液，測定各樣品在510 nm處的吸光度。

1.3.4 超氧陰離子清除率的測定 分別于6個10 mL錐形瓶中加入pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液4.5 mL，再加入0～100.0 μg/mL蜂膠乙醇萃取液4.2 mL，混勻，25 ℃水浴20 min后，加入25 ℃預(yù)熱的3 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL（以10 mmol/L HCl 配制，設(shè)置相同濃度HCl溶液為空白對照） ，迅速搖勻后倒入比色杯，于325 nm處間隔30 s測吸光度，計算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值。

1.3.5 DPPH自由基清除率的測定 分別于6個三角形瓶中加入2.0 mL的0～100.0 μg/mL的蜂膠萃取液，再加入0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液2 mL，充分混勻后，室溫避光靜置30 min后，于517 nm處測定吸光度。

1.3.6 動物試驗 將小鼠隨機分為4組，包括：對照組、低劑量、中劑量組和高劑量組，每組12只。飼養(yǎng)試驗劑量分別對應(yīng)為0.0、0.3、0.5和1.5 g/kg的蜂膠萃取物乙醇液，對照組給同體積去離子水，采取灌胃法（0.2 mL/10 g體重，間隔24 h）連續(xù)給予受試小鼠28 d后，測定如下指標(biāo)：

1）游泳試驗。末次給予小鼠不同劑量的蜂膠液30 min后，小鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛皮，放入水溫25 ℃、水深35 cm的游泳箱中，記錄自游泳開始至頭部全部沉入水中不能浮出水面的時間作為小鼠游泳時間。

2）爬桿試驗。末次給予小鼠不同劑量的蜂膠液30 min后，將小鼠放在爬桿架的有機玻璃棒上，使其肌肉處于緊張狀態(tài)，記錄小鼠由于肌肉疲勞跌落下來的時間，第3次跌落時終止試驗，累計3次時間為爬桿時間。

3）血尿素的測定。末次給予小鼠不同劑量的蜂膠液30 min后，將小鼠置于25 ℃游泳箱中游泳90 min，休息60 min后眼內(nèi)眥靜脈叢取血，血清用試劑盒（二乙酰一肟法）測定血尿素含量。

4）血乳酸的測定。末次給予小鼠不同劑量的蜂膠液30 min后，將小鼠放于30 ℃的水中負(fù)重5%體重游泳10 min后，分別于游泳前以及游泳后的0、20、60 min，在小鼠眼內(nèi)眥靜脈叢取血。于5 mL離心管中加入1%（m/V） NaF溶液0.48 mL，吸取全血20 μL加入離心管底部，用離心管上清液沖洗微量吸管數(shù)次，再加入蛋白沉淀劑1.5 mL，振蕩混勻，3 000 r/min 離心10 min，取上清液用濃硫酸-對羥基聯(lián)苯法測定血乳酸含量。

5）肝糖原的測定。末次給予小鼠不同劑量的蜂膠液30 min后，將小鼠于30 ℃的水中游泳90 min，立即處死小鼠，精確稱取200 mg鼠肝，加入4 mL三氯乙酸（TCA），勻漿1 min，3 000 r/min離心15 min，取上清液至另一試管內(nèi)，在沉淀中加入TCA 4 mL，勻漿1 min，離心15 min后合并上清液，充分混勻。取 1 mL 上清液，每管加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇4 mL，充分混勻，室溫過夜，3 000 r/min離心15 min，棄上清，加入1 mL 去離子水充分溶解沉淀后用蒽酮法測定肝糖原含量。

6）肌糖原的測定。末次給予小鼠不同劑量的蜂膠提取液30 min后，將小鼠放于30 ℃的水中游泳90 min，立即處死小鼠，取出后腿部肌肉，以0.9% （m/V） NaCl 溶液沖洗，用濾紙吸干，準(zhǔn)確稱取1.000 g肌肉于盛有3 mL 30% （m/V） KOH 的試管中，沸水浴20 min，冷卻后將其轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，以去離子水多次洗滌，合并收集，再次沸水浴10 min，冷卻后定容，并于620 nm處測定肌糖原含量。

1.3.7 抑菌試驗 稱取適量1.3.1中的蜂膠萃取物，以體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇稀釋成0.8%、0.4%、0.2%、0.1%蜂膠液。從新鮮菌苔斜面上挑取一環(huán)供試菌，接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，細(xì)菌于37 ℃搖床培養(yǎng)18 h，真菌于28 ℃搖床培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后用無菌水制備成約109 CFU/mL的菌懸液，備用。

1）抑菌圈的測定。吸取0.2 mL上述菌懸液，分別涂布于牛肉膏蛋白胨平板或馬鈴薯瓊脂糖平板上，每菌設(shè)3個平行。取滅菌圓形濾紙片（D=12.5 mm），分別浸入不同濃度蜂膠提取液中浸泡l h，以體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇為空白對照。將濾紙片置于平板中央后，倒置平板，4 ℃靜置2 h，再置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，其中細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌28 ℃培養(yǎng)48 h），測定抑菌圈直徑的平均值。

2）最小抑菌濃度的測定。配制菌液終濃度為106 CFU/mL以及梯度濃度的蜂膠萃取物液體培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨或者馬鈴薯瓊脂糖），同時以無菌生理鹽水為空白對照。將其置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)（細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌28 ℃培養(yǎng)48 h）中，觀察微生物生長情況，確定最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原力的測定

BHT、PG和蜂膠萃取液的吸光度隨濃度增大逐漸增加，其增加的趨勢為：蜂膠>BHT>PG，蜂膠在12 μg/mL時的還原力高于80 μg/mL的PG和60 μg/mL的BHT。三者的還原力均與其濃度呈線性關(guān)系，其中蜂膠的回歸方程為y=-0.016 2+0.054 9x，r2=0.939 9，F(xiàn)=62.559；BHT的回歸方程為y=-108.330 7+1.725 9x，r2=0.960 6，F(xiàn)=48.808。PG的回歸方程為y=0.044 3+0.009 1x，r2=0.963 8，F(xiàn)=79.963，三者還原力強弱為：蜂膠>BHT>PG（圖1、圖2）。

2.2 對羥基自由基的清除作用

由圖3可知，蜂膠在10～150 μg/mL范圍內(nèi)對清除羥基自由基有較好的量效關(guān)系，在10～50 μg/mL范圍內(nèi)隨濃度的增加對羥基自由基的清除率明顯增強，當(dāng)濃度大于100 μg/mL時，隨濃度的增加，其清除率增加不明顯。以濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，其回歸方程為y=-0.007 9x2+1.940 8x-15.835 0，r2=0.989 4。

2.3 對超氧陰離子的清除作用

由圖4可知，在20～100 μg/mL時，蜂膠對超氧陰離子具有較好的量效關(guān)系，在40～100 μg/mL的范圍內(nèi)隨濃度的增加對超氧陰離子的清除率明顯增強。但是在濃度小于40 μg/mL時，蜂膠對超氧陰離子的清除作用不明顯。以濃度為橫坐標(biāo)、清除率為縱坐標(biāo)，得其回歸方程為y=0.009 2x2-0.270 7x+5.360 0，r2=0.997 3。

2.4 對DPPH自由基的清除作用

由圖5可知，在20～100 μg/mL時，其線性關(guān)系較差，在20～40 μg/mL和60～80 μg/mL范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。在20～100 μg/mL間，隨蜂膠濃度的增加，對DPPH自由基的清除率也增強。以濃度為橫坐標(biāo)、清除率為縱坐標(biāo)，得回歸方程為y=0.008 6x2+1.614 1x+16.600 0，r2=0.950 2，結(jié)果表明蜂膠濃度與DPPH自由基的清除率呈正相關(guān)。

2.5 蜂膠對小鼠游泳、爬桿時間的影響

蜂膠對小鼠游泳和爬桿時間的影響結(jié)果見表1。由表1可知，服用蜂膠可以顯著延長小鼠的游泳、爬桿力竭時間。試驗組與對照組相比，小鼠游泳時間、爬桿時間都有不同程度的延長。高劑量組游泳時間延長了55%（P<0.01），中劑量組游泳時間延長了34%（P<0.05），低劑量組游泳時間延長了6%（P<0.05）。高劑量組爬桿時間延長了293%（P<0.001），中劑量組爬桿時間延長了138%（P<0.001），低劑量組爬桿時間延長了125%（P<0.001）。資料表明，運動和力竭運動可引起人和動物組織器官中自由基的增多，進(jìn)而造成組織細(xì)胞的氧化損傷，如可導(dǎo)致骨骼肌、心肌、肝臟、腎臟以及胃等組織的自由基生成增多。本結(jié)果表明，蜂膠有助于消除力竭運動產(chǎn)生的自由基，降低由自由基導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化。

2.6 蜂膠對小鼠血尿素、肝糖原和肌糖原含量的影響

結(jié)果見表2，由表2可知，試驗組與對照組相比，高劑量組血尿素含量降低了17%（P<0.01），中劑量組降低了14%（P<0.05），低劑量組血尿素含量降低了4%（P<0.05）。高劑量組肝糖原含量為對照組的4.3倍（P<0.001），中劑量組肝糖原含量為對照組的3.0倍（P<0.01）；高、中劑量組肌糖原的含量均為對照組的2.0倍（P<0.01），低劑量組肌糖原的含量為對照組的1.5倍（P<0.05）。運動耐力是機體疲勞最直接、最客觀的指標(biāo)，表2表明給小鼠灌胃28 d后，小鼠蜂膠的肝糖原儲備顯著增加，肌糖原的儲備也有所增加，這是小鼠耐力增加的原因之一。在長時間游泳（90 min）后，蛋白質(zhì)和含氮化合物的分解代謝使體內(nèi)尿素含量增加，使機體對運動負(fù)荷能力的適應(yīng)力降低，而本試驗中小鼠的血尿素沒有增加反而有顯著下降，說明運動過程中小鼠的蛋白質(zhì)消耗量沒有增加。

2.7 蜂膠對血乳酸含量的影響

試驗組小鼠和對照組小鼠的血乳酸含量隨游泳時間的變化而變化，高劑量組小鼠游泳30 min比游泳10 min下降67%，對照組游泳30 min比游泳10 min下降35%，但高劑量組仍比對照組下降了32%（P<0.01）。小鼠機體因大量運動后處在高度缺氧狀態(tài)時主要依靠無氧糖酵解供給能量，乳酸是糖無氧酵解的產(chǎn)物，長時間劇烈運動使機體中乳酸積累過多，影響體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定和正常代謝過程，血乳酸水平可以反映有氧代謝能力、疲勞的產(chǎn)生和消除速度。在負(fù)重游泳后小鼠的血乳酸曲線下面積明顯減少，表明血乳酸變化幅度很?。ū?），小鼠的疲勞增加慢、消除快，可見蜂膠具有抗疲勞作用。

2.8 抑菌圈試驗

采用濾紙片法測定蜂膠超臨界萃取物對9種受試菌種的抑制作用，結(jié)果見表4。由表4可知，不同濃度（m/V）蜂膠提取液對大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣桿菌具有明顯的生長抑制作用，對黑曲霉、沙門氏菌[7]、普通變形桿菌、啤酒酵母、假絲酵母也有一定的生長抑制作用，并且濃度越大，抑菌效果越好。

2.9 最小抑菌濃度（MIC）的試驗

采用試管稀釋法測定蜂膠提取液的最低抑菌濃度，結(jié)果見表5。由表5可知，蜂膠提取液對細(xì)菌的抑制作用明顯強于真菌，9種菌的MIC為25～1 600 μg/mL。蜂膠提取物對革蘭氏陽性菌抑菌作用較好，對革蘭氏陰性菌抑制作用不顯著。

3 小結(jié)

蜂膠在12 μg/mL時的還原力比80 μg/mL的PG和60 μg/mL的BHT高，三者的還原力強弱依次為蜂膠>BHT>PG；蜂膠在10～150 μg/mL 范圍內(nèi)對清除羥基有較好的量效關(guān)系；在20～100 μg/mL范圍，對超氧陰離子自由基具有比較好的量效關(guān)系，蜂膠的濃度越大，清除自由基的能力越強。動物試驗表明，蜂膠可以顯著延長小鼠的游泳、爬桿力竭時間，其抗疲勞作用顯著。蜂膠提取液對細(xì)菌的抑制作用明顯強于真菌，蜂膠提取物對革蘭氏陽性菌抑菌作用較好，對革蘭氏陰性菌抑制作用不顯著。

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