摘要：根據(jù)鴨疫里默氏桿菌全基因組序列，設(shè)計(jì)一對特異性引物，擴(kuò)增了siderophore基因序列，克隆至pGEM-T easy載體后進(jìn)行序列測定及分析。結(jié)果表明，閱讀框架全長為729 bp，編碼243個氨基酸。將該基因克隆到原核表達(dá)載體pET-28a后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，已成功表達(dá)28 ku的融合蛋白。

關(guān)鍵詞：鴨疫里默氏桿菌；siderophore基因；克??；表達(dá)

中圖分類號：S852.61 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2013）01-0028-03

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的一種接觸性傳染性疾病，又稱為鴨傳染性漿膜炎[1]。多見于1～8周齡的雛鴨，呈急性或慢性敗血癥，臨診上主要表現(xiàn)為眼和鼻分泌物增多、喘氣、咳嗽、下痢、共濟(jì)失調(diào)和頭頸震顫，少數(shù)慢性病例出現(xiàn)頭頸歪斜等癥狀，在病變上以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎及部分病例出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎為特征，本病呈世界性流行，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一[2-4]。為了從根本上提高對鴨疫里默氏桿菌的預(yù)防控制水平，必須對鴨疫里默氏桿菌的分子致病機(jī)制進(jìn)行全面深入的研究，對鴨疫里默氏桿菌鐵siderophore基因進(jìn)行了克隆與表達(dá)，為進(jìn)一步研究載鐵體的免疫與生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鴨疫里默氏桿菌由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供；E.coli JM109、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、原核表達(dá)載體pET-28a（+）購自寶生物（大連）工程有限公司；pGEM-T easy載體購自Promega公司；限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶購自寶生物（大連）工程有限公司。

1.2 鴨疫里默氏桿菌基因組的提取方法

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增結(jié)果

2.3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-siderophore的構(gòu)建

3 小結(jié)與討論

在自然界中絕大部分鐵要么是以細(xì)菌不能利用的化學(xué)形態(tài)的形式存在，要么是深埋于礦物顆粒中，所以自然界中細(xì)菌能夠利用的稱為生物有效鐵是很少的。在進(jìn)化過程中，許多細(xì)菌進(jìn)化獲得了攝取鐵的能力，大多通過細(xì)菌分泌一種叫鐵載體的小分子化合物（結(jié)構(gòu)不同，種類非常繁多）。鐵載體就是大多數(shù)微生物合成并輸出的一種螯合鐵的用于攝取鐵元素的低分子復(fù)合物[5，6]。它能夠?qū)㈣F離子緊緊束縛住，其他微生物就不能再將這些鐵據(jù)為己有了。鐵載體還可以幫助細(xì)菌將一些深埋于礦物或其他螯合物中的鐵離子拽出來，使得某些病原細(xì)菌敢于侵襲宿主細(xì)胞，如人體細(xì)胞中的鐵離子是與轉(zhuǎn)移蛋白、血紅蛋白這些組分緊密結(jié)合在一起的，但病原菌使用鐵載體奪取這些鐵離子很容易，鐵載體就被稱為這些病原侵犯人體的一把殺手锏。

載鐵體（siderophore）是細(xì)菌在低鐵環(huán)境中產(chǎn)生的一類低分子有機(jī)化合物，它們對鐵有高度的親和力，能與鐵發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)，是細(xì)菌獲鐵系統(tǒng)的重要組成部分，因此載鐵體與許多細(xì)菌的致病性密切相關(guān)[7]。鴨疫里默氏桿菌能引起1～8周齡小鴨急性或慢性敗血癥，病變上以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎為主要特征，關(guān)于它的外膜蛋白A等致病因子已有研究[8]，但載鐵體的研究迄今尚未在國內(nèi)見相關(guān)報(bào)道。本研究擴(kuò)增了鴨疫里默氏桿菌siderophore基因，并成功構(gòu)建了pET-28a-siderophore原核表達(dá)載體，在IPTG的誘導(dǎo)下高效表達(dá)了融合蛋白His-siderophore，這一切的研究都足以為開發(fā)新的鴨疫里默氏桿菌病診斷抗原或亞單位疫苗奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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