摘要：結(jié)合國內(nèi)外對豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2）的研究，重點對豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因及其編碼蛋白的抗原表位和功能應(yīng)用研究進行簡要綜述，為豬圓環(huán)病毒2型新型疫苗研究和建立診斷檢測方法研究方面提供參考。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒；ORF2 基因；抗原表位

中圖分類號：S858.28 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2013）01-0078-04

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV2） ，是引起豬斷奶后衰竭綜合征（Postweaning multisystemic Wasting Syndrome，PMWS）的主要病原之一。該病毒基因組為單股環(huán)狀負鏈DNA 分子，有11個開放閱讀框（ORF） ，ORF2 編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白-衣殼蛋白，具有較好的免疫基因原性，可以刺激機體產(chǎn)生抗體?，F(xiàn)將PCV2 ORF2基因及其編碼蛋白的研究概況做一綜述，以供參考。

1 結(jié)構(gòu)蛋白及抗原表位研究

在PCV2 中，ORF2起始密碼子起始于第1 033 或1 034 位核苷酸，共有702 個堿基，編碼234 個氨基酸（基因序列反義鏈上ORF2終止子由TAA變?yōu)锳AG，而造成ORF2閱讀框加長，全長705bp，其終止子為TGA），編碼的衣殼蛋白為病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白（Cap蛋白），相對分子質(zhì)量為30 000，具有較好的免疫原性，ORF2蛋白可以自我裝配成病毒衣殼顆粒，且兩種病毒之間的同源性達到67%。PCV兩種基因型的Cap蛋白上存在共同的抗原表位，但兩者無抗原交叉性，推測原因是整個Cap蛋白遮蓋了它們共同的抗原表位。在PCV1-Cap蛋白上的102～104位氨基酸（NYS）上和PCV2的143～145位氨基酸（NYS）上都有單一的糖基化表位存在[3]。Liu等[4]將ORF2基因連接到MBP-His（8）-tag基因的3'端，在細菌中表達ORF2融合蛋白，該融合蛋白可被抗PCV2多克隆抗體和PCV2感染豬的血清識別，表明ORF2蛋白與PCV2的免疫反應(yīng)性有關(guān)。融合蛋白純化后，經(jīng)電鏡負染觀察可見病毒粒子樣的顆粒，顆粒密度比PCV2病毒粒子的密度要低，但形態(tài)與病毒粒子相似，直徑約為17nm。

研究表明，ORF2基因編碼的N端41個氨基酸為核定位信號，不包含主要的抗原區(qū)域，而且N端具有大腸桿菌稀有密碼子（約占30），以AGGAGG，AGAAGG等串聯(lián)形式存在影響外源蛋白的表達[5]。Lekcharoensuk等[5]使用PCV2全病毒研制了7種不同的抗PCV2衣殼蛋白的單克隆抗體，通過對PCV2 ORF2的基因序列分析，克隆PCV1相同位點基因片段進行置換，構(gòu)建了不同的PCV1/PCV2-ORF2嵌合體。通過ELISA試驗，用各種單克隆抗體對不同的嵌合體進行識別，在ORF2的第47～63、165～200以及C端最后4個氨基酸具有至少5個重疊的B淋巴細胞抗原表位。劉光清等[6]以PCV2基因組序列為材料，采用Garnier-Robson方法、Chou-Farplus方法和Karplus-Schulz方法預測了其結(jié)構(gòu)蛋白的二級結(jié)構(gòu)；采用Kyte-Doolittle方法對結(jié)構(gòu)蛋白的親水性進行了分析，采用Emini方法預測了結(jié)構(gòu)蛋白的表面可能性，采用Jameson-Wolf方法預測了蛋白的抗原指數(shù)，綜合評價了PCV-2型結(jié)構(gòu)蛋白的B淋巴細胞抗原表位。結(jié)果表明，PCV-2結(jié)構(gòu)蛋白形成α螺旋結(jié)構(gòu)的能力弱，但是該蛋白含有較多的β折疊和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，即具有豐富的二級結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)蛋白中具有多處抗原指數(shù)較高的區(qū)段，其中羧基端含有潛在的B淋巴細胞優(yōu)勢抗原表位，為豬圓環(huán)病毒的反向疫苗學的研究提供了一定的理論依據(jù)。Stevenson等[7]對PCV2 ORF1、ORF2、ORF3進行了T淋巴細胞抗原表位分析，分別構(gòu)建了20個線性的重疊交錯抗原表位表達系統(tǒng)，通過免疫豬后對抗原表位免疫顯性的初篩以及進一步的選擇，證明了在ORF1的氨基酸殘基第81～100位和201～220位，以及ORF3氨基酸殘基31～50位存在重疊的T淋巴細胞抗原表位。而在ORF2上沒有線性的T淋巴細胞抗原表位，這可能是因為T淋巴細胞反應(yīng)和核衣殼蛋白的構(gòu)象有關(guān)。

2 ORF2蛋白的功能研究

2.1 疫苗研究

有研究表明，PCV2 ORF2某些基因與病毒的毒力和復制有關(guān)。Fenaux等[8]將圓環(huán)病毒2型在PK-15上連續(xù)傳代120次，同時收集不同代次的病毒1，對其進行生物學，遺傳學以及試驗特性分析。VP120（120代病毒）位于衣殼蛋白基因的兩處核苷酸發(fā)生突變。以PCV2 VP1、VP120的半數(shù)感染量分別用滴鼻和肌肉注射方式感染試驗豬，并設(shè)生理鹽水對照。結(jié)果表明，VP120更大的感染量和更強的病理損害。此結(jié)果反應(yīng)了豬圓環(huán)病毒2型的衣殼蛋白第P110A位和R191S位突變，不僅會增強病毒在體外的生長力，且會減弱病毒的致病力，這為PCV2疫苗的研制提供了重要依據(jù)。

Ju等[9]將PCV2 ORF1-ORF2融合蛋白構(gòu)建到偽狂犬病毒TK-/gE-/LacZ+致弱株，構(gòu)建了新的重組病毒PRV-PCV。結(jié)果表明，新構(gòu)建的重組病毒PRV-PCV能夠誘導強烈的體液免疫，產(chǎn)生抗PRV抗體和抗PCV2抗體，并且能夠誘導產(chǎn)生強烈的細胞免疫。Wang等[10]克隆了PCV2 Cap蛋白基因，并將Cap蛋白基因插入腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中，將其與腺病毒骨架載體（pAdeasy-1）共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BJ5183，進行同源重組后轉(zhuǎn)染293T細胞，在293T細胞內(nèi)包裝出重組腺病毒。通過免疫熒光、PCR和Westernblot檢測證明PCV2 Cap蛋白基因在293T細胞內(nèi)獲得表達。Gillespie[11]用非致病的PCV1衣殼蛋白替換了PCV2的衣殼蛋白，研制了抗PCV2的疫苗，將其命名為PCV1-2嵌合體。將其衣殼蛋白的第79位氨基酸突變作為示蹤標記，通過體外細胞傳代和動物體內(nèi)傳代試驗對新構(gòu)建的PCV1-2嵌合體病毒的遺傳穩(wěn)定性進行研究，結(jié)果表明，PCV1-2嵌合體病毒具有很好的遺傳穩(wěn)定性。PCV1-2嵌合病毒有望發(fā)展成為一種基因工程弱毒活疫苗而用于PCV2感染的防制。徐志文等[12]將包含有完整閱讀框架，長分別為1 740、705bp的PPV VP2基因、PCV2 ORF2基因分別插入真核表達載體pPI-2-EGFP，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPI-2-EGFP-VP2-ORF2將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Vero細胞，在轉(zhuǎn)染后20 h左右出現(xiàn)熒光，36 h達到高峰；對轉(zhuǎn)染細胞進行電鏡檢測，觀察到病毒樣顆粒存在。將純化后的病毒樣顆粒免疫仔豬，檢測其血液中T淋巴細胞的動態(tài)變化和血清抗體水平。結(jié)果免疫仔豬的CD3+、CD4+ T淋巴細胞在外周血淋巴細胞中的比率均有一定程度的升高；CD8+T淋巴細胞在免疫后7～14 d有所下降，之后再升高?？贵w檢測結(jié)果表明，免疫動物血清中有較高水平的PPV、PCV2特異性抗體。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pPI-2-EGFP-VP2-ORF2成功表達并形成重組病毒樣顆粒，且該顆粒具有良好的免疫原性。筆者將PCV2結(jié)構(gòu)蛋白的B淋巴細胞表位區(qū)（47～85aa）連入PPV VP2的N端，克隆到真核表達載體pCI-neo中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCI-ORF2-VP2，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Vero細胞，利用間接免疫熒光試驗證明了該質(zhì)粒能夠在體外表達。在無免疫佐劑的情況下將重組質(zhì)粒pCI-ORF2-VP2免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)其能夠誘導機體產(chǎn)生高效價的PPV/PCV2 IgG抗體，產(chǎn)生的抗體效價顯著高于滅活疫苗免疫組；并且重組質(zhì)粒免疫組能夠產(chǎn)生高于對照組的細胞免疫和體液免疫反應(yīng)[13]。這些結(jié)果都為PCV2基因工程亞單位疫苗的研究提供了依據(jù)。

王新等[14]將構(gòu)建好的pcDNA-ORF2制成核酸疫苗，按100μg/只腿部肌肉注射免疫Balb/c小白鼠，同時設(shè)pcDNA-3.1（+），PCV2全毒和PBS為對照，共免疫2次，間隔2周。分別于首免后第14天和56天采血，用ELISA法檢測抗體；第56天采用淋巴細胞增殖試驗（MTT法）和流式細胞儀（FACS）對小鼠的細胞免疫進行檢測；第56天取小鼠的心、肝、脾、肺、腎和腦等實質(zhì)器官，采用PCR方法檢測pcDNA-ORF2核酸疫苗的安全性。結(jié)果表明，pcDNA-ORF2核酸疫苗能誘導小鼠產(chǎn)生較強的細胞免疫和體液免疫應(yīng)答。PCV2 ORF2基因未整合到小鼠染色體上，證明了pcDNA-ORF2可誘導小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)，其對小鼠是安全的，并且為ORF2核酸疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

另外有學者對PCV2新型口服疫苗進行了研究。Wang等[15]將PCV2去除信號肽的Cap基因載體構(gòu)建到大腸桿菌和乳酸乳球菌E. coli/L. lactis穿梭載體pSEC-LEISS中，通過Westernblot分析證明了能夠在胞內(nèi)和胞外正確表達，將構(gòu)建好表達PCV2的菌株培養(yǎng)后，口服灌胃小鼠，發(fā)現(xiàn)在小鼠血清中能夠檢測出高水平的PCV2的IgG。

2.2 診斷方法研究

有關(guān)研究證實PCV2 ORF2基因可以用以區(qū)別鑒定PCV1和PCV2。因此，PCV2 ORF2基因廣泛應(yīng)用于臨床診斷。PCR作為一種高特異性、高敏感性的檢測方法被廣泛的應(yīng)用于PCV病原的檢測。PCR方法最初由Larochelle等[16]和Ouardani等[17]根據(jù)PCV1和PCV2的ORF2的DNA序列分別設(shè)計兩對PCR引物，建立了多重PCR的方法，可以同時檢測PCVl和PCV2。Kim等[18]建立了檢測和區(qū)分PCV1和PCV2的多重巢式PCR方法。Huang等[19]利用多重PCR 鑒別診斷豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒1型、豬圓環(huán)病毒2型、豬細小病毒。

PCV2 ORF2編碼的衣殼蛋白與病毒的抗原性有關(guān)，可作為診斷的工具，在此基礎(chǔ)上建立的間接ELISA方法可用于檢測PCV2抗體，國內(nèi)外學者對此進行了深入研究。Blanchard等[20]以GST-ORF2融合蛋白作為抗原，采用ELISA方法從322個感染PCV1、PCV2以及其他豬病毒的血清樣品中成功檢測出PCV2，且敏感性和特異性分別高達98.2%和94.5%。Walker等[21]以分離的PCV2細胞培養(yǎng)物作為抗原，PCV2特異性單抗作為競爭性反應(yīng)物，建立競爭ELISA，其敏感性和特異性達到99.58%和97.14%，這種方法可用于大規(guī)模的快速診斷PCV2。Nawagignl等[22]用細胞培養(yǎng)增殖的PCV2病毒作為抗原建立PCV2-ELISA和重組的衣殼蛋白為抗原建立ORF2-ELISA分別用于檢測PCV2和衣殼蛋白的抗體。高超[24]將豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因原核表達質(zhì)粒pET-ORF2s的BL21菌進行誘導表達并純化重組蛋白包涵體，Western-blot檢測純化蛋白，將其作為抗原包被酶標板，優(yōu)化間接ELISA條件，建立了檢測PCV2血清抗體的間接ELISA方法。這些研究為建立PCV2檢測檢測方法提供了重要依據(jù)。

3 小結(jié)

豬圓環(huán)病毒病是一種免疫抑制疾病，病毒感染可導致動物的免疫系統(tǒng)損傷，進而使其遭受其他病原的并發(fā)感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。PCV2 ORF2基因編碼病毒主要結(jié)構(gòu)Cap蛋白，并且可以自主組裝成病毒原顆粒，具有免疫原性，可刺激機體產(chǎn)生抗體。近年來，國內(nèi)外對ORF2基因及其編碼蛋白進行了大量的研究，研究者利用原核、真核表達系統(tǒng)成功表達出ORF2基因，將ORF2的免疫原性應(yīng)用到了PCV2的疫苗和ELISA的包被抗原研制上。而對ORF2基因抗原表位研究將會成為PCV2基因疫苗的又一研究方向。

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