摘要：雞傳染性貧血病（CIA）是以再生障礙性貧血和全身淋巴組織萎縮為主要特征，以侵害雛雞為主要對(duì)象的免疫抑制性疾病。對(duì)該病毒的病原學(xué)、血清學(xué)、分子生物學(xué)及診斷方法等進(jìn)行了綜述，以期對(duì)該病的研究與防控提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：雞傳染性貧血?。–IA）；免疫抑制；檢測(cè)方法

中圖分類號(hào)：S831 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X（2013）01-0082-03

雞傳染性貧血病又稱雞出血性綜合征、貧血性皮炎綜合征、藍(lán)翅病，是由雞傳染性貧血病病毒（Chicken Infectious Anaemia Virus， CIAV）引起的以雛雞再生障礙性貧血和全身淋巴組織萎縮為主要特征的免疫抑制性疾病。Yuasa等[1]首次分離到該病毒后，德國(guó)、瑞典、英國(guó)等國(guó)家學(xué)者也相繼報(bào)道發(fā)現(xiàn)該病毒。1992 年，李孝欣等[2]首次在我國(guó)分離到該病毒，隨后通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)許多地區(qū)雞群進(jìn)行CIA血清學(xué)調(diào)查和病毒分離鑒定，結(jié)果表明在我國(guó)許多地區(qū)普遍存在該病毒，一些雞場(chǎng)的陽(yáng)性率高達(dá)40%～70%。該病的發(fā)病率一般在20%～60%，高時(shí)可達(dá)100% ，死亡率一般在5%～10% ，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)60% 以上。該病主要導(dǎo)致雛雞再生障礙性貧血和免疫抑制，使雞群對(duì)其他病原的易感性增高和對(duì)某些疫苗的免疫應(yīng)答能力下降，從而容易發(fā)生繼發(fā)感染和疫苗的免疫失敗，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

1 病原學(xué)方法

1.1 病血液學(xué)檢查

采集病雞的血液，加入檸檬酸鈉抗凝劑，取1 mL抗凝血加入紅細(xì)胞壓積管中，以3000 r/min 離心30 min 。紅細(xì)胞壓積值低于27% 且骨髓黃染的判為雞傳染性貧血病陽(yáng)性。

1.2 電鏡觀察

CIAV 病毒粒子小，并且無(wú)論是感染易感動(dòng)物還是接種于敏感細(xì)胞，獲得的病毒效價(jià)都比較低，因此直接進(jìn)行電鏡觀察很難見(jiàn)到病毒粒子。直接電鏡觀察主要用于糞便、組織培養(yǎng)物中病毒的定性和新分離毒株的鑒定，也可通過(guò)純化細(xì)胞培養(yǎng)液中的病毒粒子，再經(jīng)過(guò)負(fù)染后進(jìn)行電鏡觀察，病毒粒子呈球狀，直徑為23～25 nm ，二十面體對(duì)稱。免疫電鏡（IEM）觀察比直接電鏡觀察的敏感性更高，病毒是免疫復(fù)合物的聚集狀態(tài)，鏡下更容易找到病毒粒子[3-8]。

1.3 病毒分離鑒定

病毒分離培養(yǎng)是CIAV鑒定中最常用的方法之一，一般取感染7d的雞組織進(jìn)行分離。CIAV在雞胚成纖維細(xì)胞、雞腎細(xì)胞、雞胚肝細(xì)胞等細(xì)胞上均不生長(zhǎng)，但在馬立克氏病腫瘤細(xì)胞系MDCC-MSB1、MDCC-JP2、MDCC-RP1細(xì)胞上生長(zhǎng)良好，目前普遍使用MDCC-MSB1傳代細(xì)胞做體外培養(yǎng)。其次，也可CIAV在雞的白血病病毒B淋巴細(xì)胞LSCC-1104/X5 B1、禽成骨髓細(xì)胞增生病病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系LSCC-HDII上增殖。但是一般需要6～8代培養(yǎng)才會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞病變[7]

2 血清學(xué)方法

2.1 病毒中和試驗(yàn)（VN）

NV試驗(yàn)既可用SPF雞，又可用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行，以SPF雞作中和試驗(yàn)時(shí)，將血清5倍稀釋后在56℃滅活30min，與等體積2×103TCID50/mL的CAV混合后37℃作用1 h，接種5只1日齡SPF雞，每只0.1 mL，14 d后確定其感染性，3只及以上雞發(fā)病，則判為中和抗體陽(yáng)性，1～2只雞發(fā)病判為疑似。

以培養(yǎng)細(xì)胞作中和試驗(yàn)時(shí)，感染細(xì)胞以1∶5 繼代，需經(jīng)過(guò)7次繼代，根據(jù)繼代細(xì)胞是否死亡做出判定，血清抗體中和效價(jià)以稀釋倍數(shù)的倒數(shù)表示。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

Kurian等[9]建立了一種檢測(cè)CIAV血清抗體的重組抗原ELISA 檢測(cè)法，該法將澳洲株VP1 基因克隆到工程菌表達(dá)載體中，表達(dá)出的VP1融合蛋白可以成功地用于雞CIAV抗體的ELISA檢測(cè)[9]。ELISA是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。

2.3 間接免疫熒光抗體試驗(yàn)（IFA）

MDCC-MSB1細(xì)胞培養(yǎng)收獲的病毒可作為細(xì)胞抗原檢測(cè)血清[10]。該抗原可與C IAV 陽(yáng)性血清反應(yīng)，用熒光標(biāo)記的抗雞IgG 顯示，熒光顯微鏡下觀察，在腫脹的細(xì)胞核區(qū)出現(xiàn)較小的、形態(tài)不規(guī)則的熒光染色顆?；蜉啳h(huán)狀結(jié)構(gòu)，可判為抗體陽(yáng)性。但應(yīng)設(shè)立嚴(yán)格的陽(yáng)性血清、陰性血清和非CAV感染細(xì)胞作對(duì)照，以排除非特異性熒光和可能掩蓋特異性反應(yīng)的背景染色。

3 分子生物學(xué)方法

3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

CIAV基因組很小，且各個(gè)CIAV毒株的基因組序列很保守。因而設(shè)計(jì)診斷用的通用性PCR引物是可行的。許多研究者設(shè)計(jì)了特定的寡核苷酸引物，擴(kuò)增出CIAV特異的核酸序列，特異性較高，敏感性也很好，這種方法被廣泛的應(yīng)用。劉澤文等[11]建立了CIAV快速診斷的PCR方法。Oluwayelu等[12]運(yùn)用PCR方法并結(jié)合限制性內(nèi)切酶分析（RE），發(fā)現(xiàn)尼日利亞庭院飼養(yǎng)雞對(duì)CIAV易感，并且隱性帶毒。鄧顯文等[13]研制出CIAV-PCR檢測(cè)試劑盒，證明該試劑盒該試劑盒對(duì)CIAV臨床樣品的檢測(cè)具有特異、敏感、快速和準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適合在臨床生產(chǎn)中推廣使用。

3.2 競(jìng)爭(zhēng)性P C R

劉澤文等[14]將刪除33個(gè)堿基序列的CIAV-DNA克隆進(jìn)質(zhì)粒pSBII，然后提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)過(guò)純化、定量后作為競(jìng)爭(zhēng)性模板，建立了一種定量檢測(cè)雞傳染性貧血病毒核酸方法。該方法與傳統(tǒng)方法相比，具有節(jié)省時(shí)間、節(jié)約試劑和受其他因素干擾小等特點(diǎn)。

3.3 套式PCR（Nest-PCR）

用第一次PCR擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)部的第二對(duì)（套式）引物對(duì)第一次PCR產(chǎn)物再次擴(kuò)增，可以增加特異性和靈敏度。宋秀龍等[15]設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，建立了套式PCR技術(shù)，結(jié)果表明套式PCR可以檢測(cè)到10-7稀釋的組織樣品中的病毒DNA ，敏感性明顯高于一次性PCR，并且可以在大量背景DNA 中檢測(cè)到單拷貝CIAV。

3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PC R（Real-time PC R）

Markowski 等[16]報(bào)道用Real-time PCR 對(duì)試驗(yàn)感染的細(xì)胞中CIAV 進(jìn)行了定量檢測(cè)，并證實(shí)其敏感性、特異性優(yōu)于套式PCR 。宋修慶等[17]根據(jù)雞貧血病毒（C IAV）的基因序列，選取一段高度保守的傳染性基因序列作為目的片段設(shè)計(jì)引物與探針，將該目的片段克隆到pMD18-T 載體中，作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。通過(guò)優(yōu)化熒光定量PCR 反應(yīng)條件，建立了CIAV 的熒光定量PCR 檢測(cè)方法。操作簡(jiǎn)單、快速，檢測(cè)線性范圍較寬，可達(dá)10～1010個(gè) /μL 。

3.5 核酸探針?lè)?/p>

利用脫氧核苷酸中堿基的配對(duì)性原則建立的一種檢測(cè)方法，選定病毒DNA 某段序列合成或克隆互補(bǔ)性探針序列，標(biāo)記上同位素或生物素，當(dāng)樣本中存在該段序列時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。已知的CIAV 毒株基因型組為單個(gè)血清型，故探針可適用于各地區(qū)的CIAV 檢測(cè)。Noteborn 等[18]以非放射性的地高辛標(biāo)記的CIAV 全基因組作探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，可成功檢測(cè)到CIAV 感染雞組織或感染的MSB1 細(xì)胞內(nèi)的病毒核酸。

3.6 斑點(diǎn)雜交法

姜世金等[19]曾用斑點(diǎn)雜交法對(duì)山東省4個(gè)肉雞場(chǎng)和2個(gè)肉種雞場(chǎng)的雞中CIAV、MDV（馬立克病毒）、REV（網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒） 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，除一個(gè)肉種雞場(chǎng)沒(méi)有檢測(cè)出REV以外，其他雞場(chǎng)均同時(shí)檢測(cè)出CIAV、MDV和REV。用斑點(diǎn)雜交法對(duì)病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)，能同時(shí)檢測(cè)多種病原，方便省時(shí)。該方法雖比PCR方法復(fù)雜，但其靈敏性有所提高。

3.7 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試驗(yàn)（LAMP）

鄧顯文[20]等根據(jù)基因庫(kù)中CIAV的保守序列，設(shè)計(jì)了一套特異性LAMP引物，建立了CIAV的LAMP可視化檢測(cè)方法。該法敏感性可達(dá)10fg，高于常規(guī)PCR方法10倍，反應(yīng)在l h內(nèi)完成，通過(guò)肉眼觀察顏色直接判定結(jié)果。

4 小結(jié)與討論

CIAV的血液學(xué)檢查雖然方法簡(jiǎn)單，但是容易出現(xiàn)錯(cuò)誤判斷，需要試驗(yàn)人員有較豐富的試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，不適于廣泛使用；由于感染CIAV的動(dòng)物中獲得的病毒效價(jià)都比較低，所以直接進(jìn)行電鏡觀察很難見(jiàn)到病毒粒子；病毒分離雖然是診斷CIAV的有效手段，特異性強(qiáng)，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便推廣使用。VN試 驗(yàn)既可用雛雞也可用細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行，該方法敏感性很高，但至少需2周才能完成；IFA試驗(yàn)既可檢測(cè)CIAV抗原，又可檢測(cè)CIAV抗體，該方法符合率極高，使用較多。但是在檢測(cè)雞血清中低濃度的CIAV抗體方面，IFA試驗(yàn)的敏感性不如VN試驗(yàn)的敏感性高。ELISA方 法已經(jīng)建立了商品化的ELISA試 劑盒，該法敏感性高，特異性強(qiáng)，已被世界各國(guó)廣泛采用。一般而言，ELISA法比VN 試 驗(yàn)和IFA試驗(yàn)敏感，而且特異性與IFA試驗(yàn)相一致。但是，該方法需要比較完備的試驗(yàn)儀器和經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員來(lái)操作和判斷結(jié)果，檢測(cè)一批樣品整個(gè)流程需要24h，對(duì)于基層獸醫(yī)站不適用。

PCR反應(yīng)具有高度的特異性和敏感性，該技術(shù)已成為目前檢測(cè)禽類疫苗中CIAV污染的首選方法。然而模板DNA在提取過(guò)程中易污染，導(dǎo)致反應(yīng)易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。競(jìng)爭(zhēng)性PCR這種方法特異性強(qiáng)敏感性高，較傳統(tǒng)的血清中和反應(yīng)作定量檢測(cè)可大大節(jié)約時(shí)間和成本，因此該方法常用于分析病毒的定量和病毒在體內(nèi)的分布等。Real-time PCR靈敏度高，可檢出10個(gè)/μL的病毒量，特異性強(qiáng)、結(jié)果穩(wěn)定，具有較好的應(yīng)用前景。核酸探針?lè)ň哂胁僮骱?jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但是它的靈敏度低于PCR方法，而且放射標(biāo)記費(fèi)用高，需要有特殊的儀器和藥品，且技術(shù)含量高，不適宜實(shí)驗(yàn)室的日常診斷，很難在基層推廣應(yīng)用。LAMP方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異，不需要像PCR那樣進(jìn)行凝膠電泳，可用于CIAV感染的快速檢測(cè)，適合在基層獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場(chǎng)中進(jìn)行。但是該方法引物設(shè)計(jì)要求比較高，在試驗(yàn)過(guò)程中開(kāi)蓋容易形成氣溶膠污染，加上目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室不能嚴(yán)格分區(qū)，假陽(yáng)性問(wèn)題比較嚴(yán)重。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是實(shí)驗(yàn)室最常用的CIAV的檢測(cè)方法，其操作簡(jiǎn)單，靈敏度也比較高，比較適合廣泛使用。Real-time PCR、LAMP等方法是近年來(lái)比較新的診斷方法，特異性、靈敏度都有很大提高，但是大規(guī)模推廣還有待于進(jìn)一步完善。由于雞傳染性貧血病目前尚無(wú)特異的治療方法，除了加強(qiáng)雞群的日常飼養(yǎng)管理，通常使用抗生素來(lái)減少繼發(fā)感染。

參考文獻(xiàn)：

[1] YUASA N，TANIGUCHI T，GODA M，et al.Isolation of chicken anemia agent with MDCC-MSB1 cells from chickens in the field[J].National Institute of Animal Health Quarterly，1983，23（3）： 75-77.

[2] 李孝欣.雞貧血因子的分離鑒定[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，1992.

[3] HAGOOD L T，KELLY T F，WRIGHT J C，et al. Evaluation of chicken infectious anemia virus and associated risk factors with diseaseandproductionlossesinbroilers[J].Avian Diseases，2001，44（4）： 803-808.

[4] MCNULTY M S，CONNOR T J，MCNEILLY F，et al. A serological survey of domestic poultry in the United Kingdom for antibody to chicken anaemia agent[J]. Avian Pathology ： Journal of the W.V.P.a，1988，17（2）： 315-324.

[5] MCILROY S G，MCNULTY M S，BRUCE D W，et al. Economic effects of clinical chicken anemia agent infection on profitable broiler production[J]. Avian Diseases，1992， 36（3）： 566-574.

[6] 谷守林，高磊，榮駿弓，等 應(yīng)用電鏡技術(shù)對(duì)病毒混合感染的研究[J].電子顯微學(xué)報(bào)，2000，19（3）：331-332.

[7] YUASA N. Propagation and infectivity titration of the Gifu-1 strain of chicken anemia agent in a cell line （MDCC-MSB1） derived from Marek's disease lymphoma[J]. National Institute of Animal Health Quarterly，1983，23（1）： 13-20.

[8] 朱雪冬，李雨來(lái).雞傳染性貧血病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)[J].畜牧與飼料科學(xué)，2009，30（11）：123-125.

[9] A. KURI A，NE.J. NEUMANN.WF，HALL，et al. Effects of blood sample mishandling on ELISA results for infectious bronchitis virus， avian encephalomyelitis virus and chicken anaemia virus[J]. The Veterinary Journal，2012，192（3）： 378-381.

[10] DAVIDSON I，ARTZI N，SHKODA I，et al. The contribution of feathers in the spread of chicken anemia virus[J]. Virus Research，2008，132（1-2）： 152-159.

[11] 劉澤文，邵華斌，楊峻，等.應(yīng)用PCR方法檢測(cè)雞傳染性貧血病毒[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2004（4）：30-31.

[12] OLUWAYELU D O，TODD D，OLALEYE O D. Sequence and phylogenetic analysis of chicken anaemia virus obtained from backyard and commercial chickens in Nigeria[J]. The Onderstepoort Journal of Veterinary Research，2008，75（4）： 353-357.

[13] 鄧顯文，謝芝勛，謝麗基，等.雞傳染性貧血病PCR試劑盒技術(shù)的研究及應(yīng)用[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，40（2）：203-206.

[14] 劉澤文，徐滌平，周平華，等.競(jìng)爭(zhēng)性PCR定量檢測(cè)雞傳染性貧血病毒核酸[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，27（3）：227-229.

[15] 宋秀龍，陳獎(jiǎng)勵(lì)，辛九慶.雞貧血病病毒套式PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，22（3）：220-223.

[16] MARKOWSKI-GRIMSRUD C J，MILLER M M，SCHAT K A. Development of strain-specific real-time PCR and RT-PCR assays for quantitation of chicken anemia virus[J]. Journal of Virological Methods，2002，101（1-2）： 135-147.

[17] 宋修慶，高宏雷，王曉艷，等.雞貧血病毒Taq Man探針熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31（1）：56-59.

[18] NOTEBORN M H. Proteins selectively killing tumor cells[J]. European Journal of Pharmacology， 2009， 625（1-3）： 165-173.

[19] 姜世金，張志，孫淑紅，等.用斑點(diǎn)雜交法同時(shí)檢測(cè)雞群中的CAV MDV和REV[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2003，39（5）：6-8.

[20] 鄧顯文，謝芝勛，謝志勤，等.雞傳染性貧血病毒病LAMP快速可視化檢測(cè)方法的建立[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，32（6）：57-60.