摘要：采用ＳＤＳ法、簡易提取法、高鹽沉淀法和改良的ＣＴＡＢ法從油松（Ｐｉｎｕｓ ｔａｂｕｌａｅｆｏｒｍｉｓ）針葉提取基因組ＤＮＡ，通過瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度法和ＰＣＲ檢測提取的ＤＮＡ質(zhì)量。結(jié)果表明，改良的ＣＴＡＢ法提取的油松針葉基因組ＤＮＡ濃度和純度高，適合用于ＩＳＳＲ－ＰＣＲ分析，優(yōu)于其他３種提取方法。

關(guān)鍵詞：油松（Ｐｉｎｕｓ ｔａｂｕｌａｅｆｏｒｍｉｓ）；ＳＤＳ法；簡易提取法；高鹽沉淀法；改良的ＣＴＡＢ法；ＤＮＡ提取

中圖分類號：Ｓ７９１．２５４；Ｑ９４６．２ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）17－3876-03

Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｆｏｕｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｎｅｅｄｌｅｓ ｏｆ Ｐｉｎｕｓ ｔａｂｕｌａｅｆｏｒｍｉｓ

ＬＩ Ｍｉｎｇ1a，ＹＵＡＮ Ｓｈｅｎｇ－ｌｉａｎｇ1b，ＧＡＯ Ｂａｏ－ｊｉａ1c，2

（１ａ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Lｉｆｅ Sｃｉｅｎｃｅｓ； １ｂ． Ｇｒａｄｕａｔｅ Sｃｈｏｏｌ； １ｃ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Fｏｒｅｓｔ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ， Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００1，Ｈｅｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｈｅｂｅｉ Ｎｏｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｚｈａｎｇｊｉａｋｏｕ ０７５０００，Ｈｅｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ， ｓｉｍｐｌｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ， ｈｉｇｈ ｓａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｎｅｅｄｌｅ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｐｉｎｅ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｂｕｌａｅｆｏｒｍｉｓ）． Ａｎｄ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ＤＮＡ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ３ ｍｅｔｈｏｄｓ， ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐ． ｔａｂｕｌａｅｆｏｒｍｉｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｉｎｕｓ ｔａｂｕｌａｅｆｏｒｍｉｓ； ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ； ｓｉｍｐｌｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ； ｈｉｇｈ ｓａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ； ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ； ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

油松（Ｐｉｎｕｓ ｔａｂｕｌａｅｆｏｒｍｉｓ）是中國特有樹種，是構(gòu)成中國北方溫帶針葉林的主要建群樹種之一，其適應(yīng)性強、樹形美觀、四季常青，可作為重要的工業(yè)用材、荒山造林和城鎮(zhèn)綠化樹種。目前對油松分子水平的遺傳變異已有一定研究［１－４］，但由于油松含有大量次生物質(zhì)，屬于頑拗植物，提取高質(zhì)量的基因組ＤＮＡ具有一定難度，是制約實驗進(jìn)展的關(guān)鍵因素之一［５－１２］。本研究在總結(jié)目前常用的幾種植物基因組ＤＮＡ提取方法的基礎(chǔ)上，采用SDS法、簡易提取法、高鹽沉淀法和改良的CTAB法４種方法從油松針葉中提取總ＤＮＡ，并通過瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度法對提取效果進(jìn)行評估和檢測，以期為油松的分子生物學(xué)和群體遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

１ 材料和方法

１．１ 材料與儀器

實驗用油松材料于２００９年７月采于河北省遼河源國家級森林公園（北緯４１°００′－４１°１０′，東經(jīng)１１８°３０′－１１８°４０′），采集當(dāng)年生幼嫩針葉置于冰盒中帶回實驗室，于－７０ ℃超低溫冰箱中保存。提取ＤＮＡ之前用７０％的乙醇（體積分?jǐn)?shù)，下同）清洗表面或浸泡１ ｍｉｎ以去除外源的ＤＮＡ污染，并用滅菌水沖洗干凈。

ＴＧＬ１６Ｍ離心機，長沙易達(dá)技貿(mào)有限公司；ＨＨ－４水浴鍋、ＨＹ－５回旋式振蕩器，金壇市杰瑞爾電器有限公司；ＬＳ－ＣＳＯＬ型立式滅菌鍋，北京瑞澤康生物科技有限公司；ＤＹＹ－２Ｃ電泳儀，北京市六一儀器廠；凝膠成像儀，Ｂｉｏ－Ｒａｄ；９７００型ＰＣＲ儀，ＡＢＩ。

１．２ 油松針葉基因組ＤＮＡ的提取

１．２．１ ＳＤＳ法 ①取油松針葉２ ｇ，加液氮研磨成粉末，加入１ ｍＬ ＳＤＳ提取緩沖液（１５ ｍｇ／Ｌ ＳＤＳ、１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、５００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，ｐＨ ８．０）和１／５體積１０％ ＳＤＳ提取液（０．１ ｇ／Ｌ ＳＤＳ、１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、５００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，ｐＨ ８．０）于１．５ ｍＬ離心管中，６５ ℃水浴１ ｈ；②加入１／１０體積的５ ｍｏｌ／Ｌ ＫＡｃ，冰浴３０ ｍｉｎ，４ ℃、１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ；③取上清液，加入等體積的Ｔｒｉｓ酚－氯仿－異戊醇（體積比２５∶２４∶１，下同）輕輕混合，４ ℃、１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ；④取上清液，加入等體積的氯仿-異戊醇（體積比２４∶１，下同）輕輕混合，４ ℃、１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ；⑤取上清液，加入等體積預(yù)冷的異戊醇，輕輕混合后于－２０ ℃放置１ ｈ；１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，去上清液；⑥沉淀用７０％的乙醇洗２次，去乙醇后自然干燥，加入１ ｍＬ ＴＥ溶解，加２ μＬ ＲＮａｓｅＡ ３７ ℃水?。常?ｍｉｎ；⑦加入２倍體積預(yù)冷的無水乙醇于－２０ ℃放置３０ ｍｉｎ，４ ℃、１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，去上清液；⑧將沉淀自然干燥后加入５０ μＬ ＴＥ，４ ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

１．２．２ 簡易提取法 ①稱取１ ｇ油松針葉，用液氮研磨至細(xì)粉狀后，迅速倒入裝有１ ｍＬ預(yù)熱至６５ ℃的ＤＮＡ提取液（１００ ｍｍｏｌ／ Ｌ Ｔｒｉｓ -ＨＣｌ、１．４ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２０ ｍｍｏｌ／ Ｌ ＣＴＡＢ）以及１％ ＰＶＰ和０．４％ β－巰基乙醇（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的離心管中，充分搖勻后６５ ℃水?。常?ｍｉｎ，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ；②取上清液，加入等體積的氯仿－異戊醇，充分混勻后８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，重復(fù)抽提２次；③取上清液，加入２．５倍體積預(yù)冷的無水乙醇，在－２０ ℃靜置１ ｈ后８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ；④所得沉淀用７０％的乙醇洗滌２次，風(fēng)干后溶于５０ μＬ ＴＥ。

１．２．３ 高鹽沉淀法 將簡易提取法所得ＤＮＡ溶于５０ μＬ ＴＥ后加入適量４ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，使溶液中的ＮａＣｌ終濃度達(dá)到２．５ ｍｏｌ／Ｌ，再次用無水乙醇沉淀ＤＮＡ，洗滌風(fēng)干后溶于５０ μＬ ＴＥ。

１．２．４ 改良的ＣＴＡＢ法 ①稱?。?ｇ油松針葉，用液氮研磨至粉末狀。迅速倒入１．５ ｍＬ預(yù)冷的離心管中，加入１ ｍＬ ＣＴＡＢ洗液（０．２ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，０．２５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ），充分搖勻后冰?。保?ｍｉｎ，４ ℃、１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄上清液，②加入預(yù)熱的６５０ μＬ ２×ＣＴＡＢ提取液（２０ ｍｇ／Ｌ ＣＴＡＢ、０．１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ）以及２％ＰＶＰ和４％β－巰基乙醇，６５ ℃水?。常?ｍｉｎ；③加入等體積的氯仿－異戊醇輕輕混合，搖勻１０ ｍｉｎ，４ ℃、１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ；④取上清液，加入２ μＬ ＲＮａｓｅＡ，３７ ℃溫?。?ｈ后重復(fù)步驟③；⑤取上清液，加入５０ μＬ ５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ 溶液，混勻后加入２．５倍體積的無水乙醇，輕輕混合，于－２０ ℃放置１ ｈ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，；⑥所得沉淀用７０％的乙醇洗滌２次，風(fēng)干后溶于５０ μＬ ＴＥ中，４ ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

１．３ ＤＮＡ質(zhì)量的檢測

①瓊脂糖凝膠電泳。?。?μＬ提取的ＤＮＡ直接進(jìn)行０．８％的瓊脂糖凝膠電泳，Ｂｉｏ－Ｒａｄ凝膠成像儀照相。②紫外分光光度法。用紫外分光光度法檢測所提取的ＤＮＡ純度。③ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)。以提取的ＤＮＡ溶液為模板進(jìn)行ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)１．５％的瓊脂糖凝膠電泳，拍照分析。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

采用０．８％的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的ＤＮＡ，電泳結(jié)果見圖１。由圖１可以看出，ＳＤＳ法提取的ＤＮＡ沒有電泳出清晰的條帶，說明提取的ＤＮＡ濃度過低；簡易提取法獲得的ＤＮＡ條帶清晰，但點樣孔明亮，說明蛋白及多糖去除效果不理想，另外其ＤＮＡ條帶存在明顯的拖尾現(xiàn)象，說明提取過程中發(fā)生了ＤＮＡ的降解；高鹽沉淀法是在簡易提取法的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，其條帶亮度僅次于簡易提取法，但也存在一定拖尾現(xiàn)象；而采用改良的ＣＴＡＢ法提取的油松基因組ＤＮＡ沉淀呈白色、半透明，電泳條帶清晰、整齊、亮度均一，無拖尾，點樣孔無發(fā)亮現(xiàn)象，說明樣品中蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)的去除較徹底?？梢姼牧嫉模茫裕粒路ㄌ崛⌒Ч詈?，高鹽沉淀法次之，ＳＤＳ法效果最差。

２．２ 紫外分光光度法檢測結(jié)果

采用紫外分光光度法進(jìn)一步檢測改良的ＣＴＡＢ法獲得的基因組ＤＮＡ純度和質(zhì)量濃度。結(jié)果（表１）表明，改良的ＣＴＡＢ法提取的油松基因組ＤＮＡ的ＯＤ２６０ ｎｍ／ＯＤ２８０ ｎｍ均在在１．８～２．０，說明其純度較高，蛋白質(zhì)、酚類及多糖類雜質(zhì)去除較完全。

２．３ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)結(jié)果

?。捶N方法提取的ＤＮＡ樣本，稀釋為１０ ｎｇ／μＬ，作為模板進(jìn)行ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)［１３］，擴增產(chǎn)物進(jìn)行１．５％瓊脂糖凝膠電泳，成像結(jié)果見圖２。從圖中可以看出，用高鹽沉淀法提取的ＤＮＡ作為模板，ＩＳＳＲ－ＰＣＲ擴增產(chǎn)物條帶較清晰，但條帶數(shù)量較少，穩(wěn)定性較差；而ＳＤＳ法提取的ＤＮＡ用于ＰＣＲ，條帶清晰度差，數(shù)量少；以簡易提取法所得的ＤＮＡ為模板，ＰＣＲ擴增效果最差，基本沒有清晰的條帶，這說明ＤＮＡ樣品中含有較多的雜質(zhì)，對ＰＣＲ反應(yīng)體系的穩(wěn)定性有一定程度的影響，可見以上３種方法提取的ＤＮＡ均不適用于油松的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ分析。而以ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ為模板，擴增產(chǎn)物條帶清晰，帶型豐富，無雜帶，可以用于油松的種群遺傳多樣性分析。

３ 結(jié)論與討論

本研究以油松針葉為材料提取基因組ＤＮＡ，實驗結(jié)果表明，改良的ＣＴＡＢ法獲得的ＤＮＡ產(chǎn)量高、質(zhì)量好，可用于ＩＳＳＲ分析。ＰＶＰ是一種酚的絡(luò)合物，同時含有親水基團和親油基團，較易溶解于極性較強的有機溶劑，可以有效去除酚類物質(zhì)。本實驗在提取緩沖液中加入適量的ＰＶＰ，可以有效去除產(chǎn)物中的酚類物質(zhì)。ＤＮＡ片段的長度對實驗結(jié)果也有一定的影響。為了得到盡可能大的ＤＮＡ片段，本研究經(jīng)過反復(fù)摸索發(fā)現(xiàn)碾磨后的提取材料中應(yīng)及時加入ＣＴＡＢ提取緩沖液，防止已粉碎或破壁后的植物組織釋放核酸酶，從而自身產(chǎn)生酶解；并應(yīng)盡量簡化操作步驟，離心的次數(shù)、轉(zhuǎn)速要適當(dāng)，離心時達(dá)到兩相分離即可；提取過程中應(yīng)溫和操作，避免劇烈震蕩，用剪去尖端的槍頭吸取上清液，吸取過程中避免產(chǎn)生氣泡，不要通過反復(fù)吸打的方法助溶ＤＮＡ；干燥ＤＮＡ沉淀時，應(yīng)注意沉淀的干燥程度，太干會導(dǎo)致沉淀不易重懸，如果沉淀難以重懸，可于６５ ℃水?。常?ｍｉｎ；在沖洗沉淀時應(yīng)用７０％的乙醇，如使用無水乙醇，體系中的離子不易去除。

另外，提取植物基因組ＤＮＡ?xí)r，要用氯仿－異戊醇抽提幾次，抽提次數(shù)不夠會導(dǎo)致蛋白等雜質(zhì)過多，但抽提次數(shù)過多則會丟失部分ＤＮＡ，這與陸嘉惠等［１４］的報道基本一致。本研究經(jīng)多次反復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)抽提次數(shù)為２～３次時可以得到質(zhì)量較高的ＤＮＡ樣品，且損失較少。

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