摘要:采用SDS法、簡易提取法、高鹽沉淀法和改良的CTAB法從油松(Pinus tabulaeformis)針葉提取基因組DNA,通過瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度法和PCR檢測提取的DNA質(zhì)量。結(jié)果表明,改良的CTAB法提取的油松針葉基因組DNA濃度和純度高,適合用于ISSR-PCR分析,優(yōu)于其他3種提取方法。
關(guān)鍵詞:油松(Pinus tabulaeformis);SDS法;簡易提取法;高鹽沉淀法;改良的CTAB法;DNA提取
中圖分類號:S791.254;Q946.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2012)17-3876-03
Comparison of Four Methods of DNA Extraction from Needles of Pinus tabulaeformis
LI Ming1a,YUAN Sheng-liang1b,GAO Bao-jia1c,2
(1a. College of Life Sciences; 1b. Graduate School; 1c. College of Forest,Agricultural University of Hebei, Baoding 071001,Hebei,China;
2. Hebei North University, Zhangjiakou 075000,Hebei,China)
Abstract: SDS method, simple extraction method, high salt extraction method and modified CTAB method were applied to extract DNA from the needle of Chinese pine(Pinus tabulaeformis). And the quality of extracted DNA was determined by agarose gel electrophoresis, UV spectrophotometry and PCR. The results showed that the concentration and purity of DNA obtained from modified CTAB method was better than that from the other 3 methods, and could be used in ISSR-PCR analysis of P. tabulaeformis.
Key words: Pinus tabulaeformis; SDS method; simple extraction method; high salt extraction method; modified CTAB method; DNA extraction
油松(Pinus tabulaeformis)是中國特有樹種,是構(gòu)成中國北方溫帶針葉林的主要建群樹種之一,其適應(yīng)性強(qiáng)、樹形美觀、四季常青,可作為重要的工業(yè)用材、荒山造林和城鎮(zhèn)綠化樹種。目前對油松分子水平的遺傳變異已有一定研究[1-4],但由于油松含有大量次生物質(zhì),屬于頑拗植物,提取高質(zhì)量的基因組DNA具有一定難度,是制約實(shí)驗(yàn)進(jìn)展的關(guān)鍵因素之一[5-12]。本研究在總結(jié)目前常用的幾種植物基因組DNA提取方法的基礎(chǔ)上,采用SDS法、簡易提取法、高鹽沉淀法和改良的CTAB法4種方法從油松針葉中提取總DNA,并通過瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度法對提取效果進(jìn)行評估和檢測,以期為油松的分子生物學(xué)和群體遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 材料與儀器
實(shí)驗(yàn)用油松材料于2009年7月采于河北省遼河源國家級森林公園(北緯41°00′-41°10′,東經(jīng)118°30′-118°40′),采集當(dāng)年生幼嫩針葉置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室,于-70 ℃超低溫冰箱中保存。提?。模危林坝茫罚埃サ囊掖迹w積分?jǐn)?shù),下同)清洗表面或浸泡1 min以去除外源的DNA污染,并用滅菌水沖洗干凈。
TGL16M離心機(jī),長沙易達(dá)技貿(mào)有限公司;HH-4水浴鍋、HY-5回旋式振蕩器,金壇市杰瑞爾電器有限公司;LS-CSOL型立式滅菌鍋,北京瑞澤康生物科技有限公司;DYY-2C電泳儀,北京市六一儀器廠;凝膠成像儀,Bio-Rad;9700型PCR儀,ABI。
1.2 油松針葉基因組DNA的提取
1.2.1 SDS法 ①取油松針葉2 g,加液氮研磨成粉末,加入1 mL SDS提取緩沖液(15 mg/L SDS、100 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、500 mmol/L NaCl,pH 8.0)和1/5體積10% SDS提取液(0.1 g/L SDS、100 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、500 mmol/L NaCl,pH 8.0)于1.5 mL離心管中,65 ℃水?。?h;②加入1/10體積的5 mol/L KAc,冰?。常?min,4 ℃、10 000 r/min離心10 min;③取上清液,加入等體積的Tris酚-氯仿-異戊醇(體積比25∶24∶1,下同)輕輕混合,4 ℃、13 000 r/min離心15 min;④取上清液,加入等體積的氯仿-異戊醇(體積比24∶1,下同)輕輕混合,4 ℃、13 000 r/min離心15 min;⑤取上清液,加入等體積預(yù)冷的異戊醇,輕輕混合后于-20 ℃放置1 h;13 000 r/min離心15 min,去上清液;⑥沉淀用70%的乙醇洗2次,去乙醇后自然干燥,加入1 mL TE溶解,加2 μL RNaseA 37 ℃水?。常?min;⑦加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇于-20 ℃放置30 min,4 ℃、13 000 r/min離心15 min,去上清液;⑧將沉淀自然干燥后加入50 μL TE,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 簡易提取法 ①稱?。?g油松針葉,用液氮研磨至細(xì)粉狀后,迅速倒入裝有1 mL預(yù)熱至65 ℃的DNA提取液(100 mmol/ L Tris -HCl、1.4 mmol/L NaCl、20 mmol/ L CTAB)以及1% PVP和0.4% β-巰基乙醇(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)的離心管中,充分搖勻后65 ℃水?。常?min,8 000 r/min離心10 min;②取上清液,加入等體積的氯仿-異戊醇,充分混勻后8 000 r/min離心10 min,重復(fù)抽提2次;③取上清液,加入2.5倍體積預(yù)冷的無水乙醇,在-20 ℃靜置1 h后8 000 r/min離心10 min;④所得沉淀用70%的乙醇洗滌2次,風(fēng)干后溶于50 μL TE。
1.2.3 高鹽沉淀法 將簡易提取法所得DNA溶于50 μL TE后加入適量4 mol/L NaCl,使溶液中的NaCl終濃度達(dá)到2.5 mol/L,再次用無水乙醇沉淀DNA,洗滌風(fēng)干后溶于50 μL TE。
1.2.4 改良的CTAB法 ①稱取1 g油松針葉,用液氮研磨至粉末狀。迅速倒入1.5 mL預(yù)冷的離心管中,加入1 mL CTAB洗液(0.2 mol/L Tris-HCl,0.25 mol/L NaCl,0.05 mol/L EDTA),充分搖勻后冰?。保?min,4 ℃、10 000 r/min離心10 min,棄上清液,②加入預(yù)熱的650 μL 2×CTAB提取液(20 mg/L CTAB、0.1 mol/L Tris-HCl、1.5 mol/L NaCl、0.05mol/L EDTA)以及2%PVP和4%β-巰基乙醇,65 ℃水?。常?min;③加入等體積的氯仿-異戊醇輕輕混合,搖勻10 min,4 ℃、10 000 r/min離心10 min;④取上清液,加入2 μL RNaseA,37 ℃溫?。?h后重復(fù)步驟③;⑤取上清液,加入50 μL 5mol/L NaCl 溶液,混勻后加入2.5倍體積的無水乙醇,輕輕混合,于-20 ℃放置1 h,12 000 r/min離心10min,;⑥所得沉淀用70%的乙醇洗滌2次,風(fēng)干后溶于50 μL TE中,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3 DNA質(zhì)量的檢測
①瓊脂糖凝膠電泳。取4 μL提取的DNA直接進(jìn)行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳,Bio-Rad凝膠成像儀照相。②紫外分光光度法。用紫外分光光度法檢測所提取的DNA純度。③ISSR-PCR反應(yīng)。以提取的DNA溶液為模板進(jìn)行ISSR-PCR反應(yīng),產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,拍照分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果
采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA,電泳結(jié)果見圖1。由圖1可以看出,SDS法提取的DNA沒有電泳出清晰的條帶,說明提取的DNA濃度過低;簡易提取法獲得的DNA條帶清晰,但點(diǎn)樣孔明亮,說明蛋白及多糖去除效果不理想,另外其DNA條帶存在明顯的拖尾現(xiàn)象,說明提取過程中發(fā)生了DNA的降解;高鹽沉淀法是在簡易提取法的基礎(chǔ)上進(jìn)行的,其條帶亮度僅次于簡易提取法,但也存在一定拖尾現(xiàn)象;而采用改良的CTAB法提取的油松基因組DNA沉淀呈白色、半透明,電泳條帶清晰、整齊、亮度均一,無拖尾,點(diǎn)樣孔無發(fā)亮現(xiàn)象,說明樣品中蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)的去除較徹底??梢姼牧嫉模茫裕粒路ㄌ崛⌒Ч詈茫啕}沉淀法次之,SDS法效果最差。
2.2 紫外分光光度法檢測結(jié)果
采用紫外分光光度法進(jìn)一步檢測改良的CTAB法獲得的基因組DNA純度和質(zhì)量濃度。結(jié)果(表1)表明,改良的CTAB法提取的油松基因組DNA的OD260 nm/OD280 nm均在在1.8~2.0,說明其純度較高,蛋白質(zhì)、酚類及多糖類雜質(zhì)去除較完全。
2.3 ISSR-PCR反應(yīng)結(jié)果
?。捶N方法提取的DNA樣本,稀釋為10 ng/μL,作為模板進(jìn)行ISSR-PCR反應(yīng)[13],擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,成像結(jié)果見圖2。從圖中可以看出,用高鹽沉淀法提取的DNA作為模板,ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶較清晰,但條帶數(shù)量較少,穩(wěn)定性較差;而SDS法提取的DNA用于PCR,條帶清晰度差,數(shù)量少;以簡易提取法所得的DNA為模板,PCR擴(kuò)增效果最差,基本沒有清晰的條帶,這說明DNA樣品中含有較多的雜質(zhì),對PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性有一定程度的影響,可見以上3種方法提取的DNA均不適用于油松的ISSR-PCR分析。而以CTAB法提取的DNA為模板,擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰,帶型豐富,無雜帶,可以用于油松的種群遺傳多樣性分析。
3 結(jié)論與討論
本研究以油松針葉為材料提取基因組DNA,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,改良的CTAB法獲得的DNA產(chǎn)量高、質(zhì)量好,可用于ISSR分析。PVP是一種酚的絡(luò)合物,同時(shí)含有親水基團(tuán)和親油基團(tuán),較易溶解于極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑,可以有效去除酚類物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)在提取緩沖液中加入適量的PVP,可以有效去除產(chǎn)物中的酚類物質(zhì)。DNA片段的長度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有一定的影響。為了得到盡可能大的DNA片段,本研究經(jīng)過反復(fù)摸索發(fā)現(xiàn)碾磨后的提取材料中應(yīng)及時(shí)加入CTAB提取緩沖液,防止已粉碎或破壁后的植物組織釋放核酸酶,從而自身產(chǎn)生酶解;并應(yīng)盡量簡化操作步驟,離心的次數(shù)、轉(zhuǎn)速要適當(dāng),離心時(shí)達(dá)到兩相分離即可;提取過程中應(yīng)溫和操作,避免劇烈震蕩,用剪去尖端的槍頭吸取上清液,吸取過程中避免產(chǎn)生氣泡,不要通過反復(fù)吸打的方法助溶DNA;干燥DNA沉淀時(shí),應(yīng)注意沉淀的干燥程度,太干會導(dǎo)致沉淀不易重懸,如果沉淀難以重懸,可于65 ℃水?。常?min;在沖洗沉淀時(shí)應(yīng)用70%的乙醇,如使用無水乙醇,體系中的離子不易去除。
另外,提取植物基因組DNA?xí)r,要用氯仿-異戊醇抽提幾次,抽提次數(shù)不夠會導(dǎo)致蛋白等雜質(zhì)過多,但抽提次數(shù)過多則會丟失部分DNA,這與陸嘉惠等[14]的報(bào)道基本一致。本研究經(jīng)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抽提次數(shù)為2~3次時(shí)可以得到質(zhì)量較高的DNA樣品,且損失較少。
參考文獻(xiàn):
[1] 李 毳,柴寶峰.基于分子標(biāo)記的油松種群遺傳保護(hù)分析[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2009,15(4):459-463.
[2] 李紅艷,羅 旭,張海峰.分子標(biāo)記在松科植物種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用[J].黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,24(3):11-15.
[3] 李 毳,柴寶峰. 油松葉綠體DNA間隔序列特點(diǎn)及系統(tǒng)學(xué)意義[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2010,16(2):143-147.
[4] 李 毳,柴寶峰,王孟本.華北地區(qū)油松種群遺傳多樣性分析[J].植物研究,2006,26(1):98-102.
[5] 李海生. ISSR分子標(biāo)記技術(shù)及其在植物遺傳多樣性分析中的應(yīng)用[J]. 生物學(xué)通報(bào),2004,39(2):19-21.
[6] 李義良,趙奮成,張應(yīng)中,等.分子標(biāo)記在松樹遺傳與進(jìn)化研究中的應(yīng)用[J].分子植物育種, 2009,7(5):1004-1009.
[7] 王 珍,方宣鈞.植物DNA分離[J].分子植物育種,2003,1(2):281-288.
[8] GUILLEMAUT P, MAR CHAL-DROUARD L. Isolation of plant DNA: A fast, inexpensive, and reliable method[J]. Plant Molecular Biology Reporter,1992,10(1):60-65.
[9] 李 丹,凌定厚. 五種提取馬尾松基因組DNA方法的比較[J]. 植物學(xué)通報(bào),2000,17(2):168-173.
[10] ZENG J, ZOU Y P, BAI J Y, et al. Preparation of total DNA from “recalcitrant plant taxa”[J]. Acta Botanica Sinica, 2002,44(6):694-697.
[11] 易慶平,羅正榮,張青林.植物總基因組DNA提取純化方法綜述[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(25):7789-7791.
[12] 王孝安,肖婭萍,胡雅琴.太白紅杉3種不同材料總DNA的提?。郏剩荩?西北植物學(xué)報(bào), 2004,23(4):641-644.
[13] 李 明,高寶嘉,張靜潔.承德光禿山不同海拔油松居群遺傳多樣性與生境因子關(guān)聯(lián)研究[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2012,13(3):350-356.
[14] 陸嘉惠,李學(xué)禹,馬 淼,等.甘草屬植物DNA提取方法研究[J].生物技術(shù),2006,16(3):45-47.