摘要：用鴨肝炎病毒（ＤＨＶ）地方分離毒株ＨＢ９８株經(jīng)雞胚連續(xù)傳５３～６２代適應(yīng)雞胚的鴨肝炎病毒作為種毒，制備成弱毒疫苗和滅活疫苗分別免疫伊莎產(chǎn)蛋雞，經(jīng)３次免疫后，收獲卵黃，測定病毒中和效價(jià)可達(dá)１０３以上，經(jīng)３０萬只雛鴨臨床應(yīng)用，對(duì)未發(fā)病的雛鴨預(yù)防保護(hù)率達(dá)９０％以上，發(fā)病鴨群治療保護(hù)率達(dá)８０％以上。

關(guān)鍵詞：鴨病毒性肝炎（Ｄｕｃｋ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ， ＤＶＨ）；高免卵黃抗體；研制

中圖分類號(hào)：Ｓ８５８．３２；Ｓ８５９．７９＋７ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）17－3789-02

Development and Application of Egg Yolk Antibody for DHV

ＹＡＮＧ Ｊｕｎ，ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｌｉｎｇ，ＷＥＮ Ｇｕｏ－ｙｕａｎ，ＬＵＯ Ｌｉｎ，ＬＵＯ Ｑｉｎｇ－ｐｉｎｇ，ＡＩ Ｄｉ－ｙｕｎ，ＺＨＡＮＧ Ｒｏｎｇ－ｒｏｎｇ，

ＳＨＡＯ Ｈｕａ－ｂｉｎ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｅｍｂｒｙｏ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｍａｓｔｅｒ ｓｅｅｄ ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ５３～６２ ｓｅｒｉａｌ ｐａｓｓａｇｅ ｏｆ ｄｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ （ＤＨＶ） ｓｔｒａｉｎ ＨＢ９８ ｉｎ ｃｈｉｃｋ ｅｍｂｒｙｏ ａｎｄ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｏｆ ＤＨＶ． Ｔｈｅ ｅｇｇ ｙｏｌｋ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｆｔｅｒ ３ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｓａ ｃｈｉｃｋ． Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｔｉｔｅｒ ｔｅｓｔｅｄ ｗａｓ ａｂｏｖｅ １０３． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ３００ ０００ ｄｕｃｋｌｉｎｇｓ， ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｅｇｇ ｙｏｌｋ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｈｅａｌｔｈｙ ｄｕｃｋｌｉｎｇ ｗａｓ ａｂｏｖｅ ９０％； ａｎｄ ｔｈｅ ｃｕｒｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｄｕｃｋｉｎｇ ｗａｓ ａｂｏｖｅ ８０％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｄｕｃｋ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ（ＤＶＨ）； ｅｇｇ ｙｏｌｋ ａｎｔｉｂｏｄｙ； ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ

鴨病毒性肝炎（Ｄｕｃｋ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＤＶＨ）是引起小鴨高度致死性、傳播迅速的病毒性疾病，主要感染５周齡以內(nèi)的雛鴨，以２周齡內(nèi)雛鴨最易感，對(duì)新生鴨可導(dǎo)致９０%以上死亡率。病鴨常在出現(xiàn)角弓反張癥狀后迅速死亡，病理剖檢特點(diǎn)為肝臟腫脹與出血。該病是危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一［１－３］。本試驗(yàn)通過采用分離的鴨肝炎病毒（ＤＨＶ）地方毒株ＨＢ９８株免疫產(chǎn)蛋雞制備抗鴨肝炎病毒高免卵黃抗體，用于預(yù)防和治療雛鴨的病毒性肝炎，獲得了理想效果。

１ 材料與方法

１．１ 試驗(yàn)材料

鴨肝炎病毒ＨＢ９８株：湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病室分離保存。鴨肝炎疫苗：鴨肝炎病毒ＨＢ９８株經(jīng)雞胚傳５３～６２代，制備活疫苗和滅活疫苗。雞胚：武漢市新洲種雞場伊莎種蛋，實(shí)驗(yàn)室孵化器孵化８～９日齡用于試驗(yàn)。蛋雞：武漢市新洲種雞場90日齡伊莎商品蛋雞，用于免疫鴨病毒性肝炎疫苗，制備高免卵黃抗體。雛鴨：武漢市春江種鴨場種蛋孵化雛鴨２周齡。

１．２ 高免卵黃抗體的制備與檢驗(yàn)

１．２．１ 產(chǎn)蛋雞的免疫 ９０日齡伊莎蛋雞用３～５倍量鴨病毒性肝炎活疫苗肌肉注射進(jìn)行首次免疫，間隔２周再用其滅活疫苗免疫２次（間隔時(shí)間為２周），１２０日齡時(shí)開始收獲雞蛋，測定卵黃中的病毒中和抗體效價(jià)。

１．２．２ 卵黃抗體的制備 收集高免雞產(chǎn)的蛋，４ ℃保存，分離卵黃，混合后置組織搗碎缸中搗碎，混合物用緩沖鹽水（內(nèi)含不超過０．２％的福爾馬林作防腐劑）稀釋，分裝后置４ ℃保存，有效期為１年。產(chǎn)品按常規(guī)方法作無菌檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)。

１．２．３ 卵黃抗體效價(jià)檢測（病毒中和試驗(yàn)） 用固定卵黃抗體稀釋病毒方法測定雞胚中的病毒中和指數(shù)。將卵黃抗體用滅菌生理鹽水作１∶４（Ｖ／Ｖ）稀釋，ＤＨＶⅠ型強(qiáng)毒分別作１０－２、１０－３、１０－４倍稀釋，將卵黃抗體和病毒液按１∶１混合，２５ ℃中和１ ｈ，同時(shí)設(shè)不中和的病毒液作對(duì)照，對(duì)照組和中和組的病毒液每個(gè)稀釋度分別接種６枚８～１０日齡ＳＰＦ雞胚，３７ ℃培養(yǎng)，觀察９６ ｈ。以１０－３稀釋度病毒中和組雞胚全部存活、對(duì)照組雞胚８０％死亡為合格。

１．２．４ 產(chǎn)品效力檢驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［４］的方法進(jìn)行。選擇２周齡無母源抗體的雛鴨１０只，肌肉注射高免卵黃抗體１．０ ｍＬ，另一組不接種卵黃抗體作對(duì)照，２４ ｈ后用１０３ ＬＤ５０ ＤＨＶⅠ型強(qiáng)毒攻擊每組雛鴨。如果試驗(yàn)組８０％雛鴨存活、對(duì)照組８０％雛鴨發(fā)病死亡，則判定產(chǎn)品合格。

１．２．５ 臨床應(yīng)用效果檢驗(yàn) 在不同地區(qū)、不同日齡的發(fā)病雛鴨群緊急注射高免卵黃抗體，２周齡以內(nèi)雛鴨注射０．５ ｍＬ，２周齡以上雛鴨注射１．０ ｍＬ，注射后１周內(nèi)觀察記錄發(fā)病死亡情況，同時(shí)設(shè)不注射卵黃抗體雛鴨作為對(duì)照。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 卵黃抗體的制備與檢驗(yàn)結(jié)果

２００６～２００７年共制備５批卵黃抗體共４２．４萬ｍＬ，免疫產(chǎn)蛋雞１００只，收集高免蛋１０ ６００枚，經(jīng)卵黃抗體效價(jià)檢測和產(chǎn)品攻毒保護(hù)效力檢測，全部合格（表１）。

２．２ 臨床應(yīng)用效果觀察

由表２可見，用５批鴨病毒性肝炎高免卵黃抗體對(duì)１５群發(fā)病雛鴨進(jìn)行緊急預(yù)防，共預(yù)防雛鴨３８ ４００只，死亡２ ６３４只，保護(hù)率達(dá)９３．１％。

２．３ 推廣應(yīng)用情況

２００６～２００８年在潛江、云夢、仙桃、監(jiān)利、武漢、大冶等市縣推廣應(yīng)用３０萬羽份，未發(fā)病的雛鴨預(yù)防保護(hù)率達(dá)９０％以上，發(fā)病鴨群治療保護(hù)率達(dá)８０％以上。注射卵黃抗體后４８～７２ ｈ控制死亡，發(fā)病鴨群越早注射卵黃抗體效果越好。

３ 小結(jié)與討論

１）鴨肝炎（ＤＨ）是雛鴨的一種高度致死性、傳播迅速的病毒性疾病，以肝炎為其主要特征。該病可由３種不同類型的病毒引起，稱為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型鴨肝炎病毒。相關(guān)資料報(bào)道和流行病學(xué)調(diào)查及病原分離鑒定證明，湖北省范圍內(nèi)的雛鴨主要是由Ⅰ型鴨肝炎病毒感染［３－５］。本試驗(yàn)通過分離的鴨肝炎病毒地方毒株范圍內(nèi)的ＨＢ９８株制備的活疫苗和滅活疫苗，免疫產(chǎn)蛋雞制備抗鴨肝炎病毒高免卵黃抗體，通過定點(diǎn)觀察和實(shí)地應(yīng)用，預(yù)防治療雛鴨的病毒性肝炎獲得理想效果。

２）有關(guān)鴨病毒性肝炎高免卵黃抗體的制備國家目前沒有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)參照文獻(xiàn)［４］的方法結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際，制定了產(chǎn)品的制備、檢驗(yàn)規(guī)程（方法），通過對(duì)５批４２．４萬ｍＬ高免卵黃抗體檢測，全部符合國際獸醫(yī)局（ＯＩＥ）推薦的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。證明鴨肝炎病毒ＨＢ９８株是１株免疫原性較好的毒株。

３）雛鴨的病毒性肝炎流行病學(xué)調(diào)查表明，該病一年四季均可發(fā)生［３］，湖北省以初夏至秋末多發(fā)，這可能與湖北省雛鴨孵化習(xí)慣有關(guān)。在防控中應(yīng)用高免卵黃抗體時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療；②活疫苗免疫失敗后可用高免卵黃抗體控制或減輕死亡；③注射高免卵黃抗體時(shí)為防止局部感染，可同時(shí)投喂２～３ ｄ的廣譜抗生素效果更好。

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