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        豬波形蛋白對PRRSV感染Marc—145細(xì)胞的抑制作用

        2012-12-31 00:00:00馬曉春孔寧等
        山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年10期

        摘 要:為了研究波形蛋白在介導(dǎo)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染細(xì)胞過程中的作用,利用RT-PCR方法從PRRSV非易感細(xì)胞系豬腎細(xì)胞系PK-15細(xì)胞中擴增目的基因,克隆入pET-28a(+)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導(dǎo)表達。表達的重組豬波形蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定和純化后免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。利用病毒抑制試驗檢測重組豬波形蛋白及多克隆抗體在PRRSV感染Marc-145細(xì)胞過程中的作用。結(jié)果表明,成功擴增豬波形蛋白基因并克隆入pET-28a載體,經(jīng)誘導(dǎo)后得到高效表達,純化后免疫兔子產(chǎn)生高價血清抗體(105)。病毒阻斷結(jié)果表明,豬波形蛋白及多克隆抗體均能阻斷PRRSV感染Marc-145細(xì)胞。 這為以波形蛋白為基礎(chǔ)的PRRSV 受體阻斷抑制劑的研究提供了實驗依據(jù)。

        關(guān)鍵詞:豬繁殖與呼吸綜合征病毒;波形蛋白;病毒抑制;受體阻斷

        中圖分類號:Q939.91 文獻標(biāo)識號:A 文章編號:1001-4942(2012)10-0001-07

        豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)能引起豬繁殖與呼吸綜合征( PRRS),俗稱豬藍耳病。臨床表現(xiàn)為母豬晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等繁殖障礙和各年齡豬群的呼吸道癥狀。該病于1996年在我國首次報道[1],給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。

        波形蛋白廣泛存在于間充質(zhì)細(xì)胞及中胚層來源的細(xì)胞中,主要與維持細(xì)胞及細(xì)胞器形態(tài)、參與有絲分裂和細(xì)胞分化、促進細(xì)胞粘附和移行、創(chuàng)傷愈合、信號傳導(dǎo)、移植免疫和細(xì)胞凋亡等有關(guān)[2~4]。波形蛋白除了穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)之外,還與其他的細(xì)胞骨架纖維一起參與許多病毒的侵入或感染過程,例如Ⅰ型皰疹病毒[5]、藍舌病毒[6]、非洲豬高熱病毒[7]、人的呼吸道合胞病毒[8]、痘病毒[9]、泰勒氏小鼠腦脊髓炎病毒[10]和日本腦炎病毒[11,12]等。

        PRRSV通過細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用感染易感細(xì)胞,從而在細(xì)胞內(nèi)完成其復(fù)制和包裝等過程,該過程涉及多種蛋白,波形蛋白為其中一種。2006年Kim等用North-Western blot方法從Marc-145細(xì)胞中檢測到與PRRSV 3′非翻譯區(qū)RNA結(jié)合的分子量為57 ku的蛋白[13],并驗證該蛋白為波形蛋白。盡管波形蛋白在進化過程中是保守的,但在不同細(xì)胞內(nèi)其執(zhí)行的功能不同,在多種病毒感染過程中都有著重要作用。王偉偉等[14]研究證明PRRSV易感細(xì)胞系Marc-145來源的猴波形蛋白及其抗體能阻斷PRRSV感染Marc-145細(xì)胞。目前已知豬是PRRSV唯一自然宿主,而豬腎細(xì)胞系PK-15細(xì)胞卻是PRRSV的非易感細(xì)胞。為了進一步研究豬波形蛋白和猴波形蛋白的功能關(guān)系及其與PRRSV的關(guān)系,本研究從豬腎細(xì)胞系PK-15中擴增出波形蛋白基因,表達純化后制備抗體,檢測豬波形蛋白及其抗體對PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的影響,為PRRSV致病機制及其受體阻斷抑制劑的研究奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 病毒、細(xì)胞與菌株

        PRRSV分離株TA-12(GenBank登陸號:HQ416720)、PK-15細(xì)胞、pET-28a (+)表達載體、受體菌E.coli Top10、表達菌BL21(DE3)均由本實驗室保存,載體pMD18-T購自TaKaRa公司。

        1.2 主要試劑

        TRIZOL購自Invitrogen公司,HiFi ploymerase、dNTP、Ni-NTA Resin、DNA純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司,T4連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ購自TaKaRa公司,異丙基-β-D-硫化半乳糖苷 (IPTG) 購自Promega公司,HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自Jackson公司,His 單克隆抗體購自南京金斯瑞公司,抗PRRSV N蛋白單克隆抗體6D10由本實驗室制備保存。

        1.3 目的基因的擴增和序列的測定

        根據(jù)GenBank上公布的牛波形蛋白序列(序列號NM_173969.3),設(shè)計并合成一對引物,上游引物5′-CAGCCATGTCCACCAGG-3′,下游引物5′-GCTGGTAGTATTTTGCTGC-3′。提取PK-15細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以其為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為:94℃ 5 min;94℃ 1 min,55℃ 45 s,72℃ 90 s,30個循環(huán);72℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后連接于pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Top10中,提取質(zhì)粒,酶切、PCR鑒定后送上海生工測序。

        1.4 重組質(zhì)粒PK-28a-VIM的構(gòu)建與鑒定

        根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計合成一對引物,上游引物5′-ATAGGATCCATGTCCACCAGGACCGT -3′(帶有BamHⅠ識別位點),下游引物5′-CGCAAGCTTTTATTCCAGATCATCGTG -3′(帶有Hind Ⅲ識別位點)。以pMD18-T-VIM為模板進行擴增。PCR反應(yīng)條件為:94℃ 5 min;94℃ 1 min,55℃ 45 s,72℃ 90 s,30個循環(huán); 72℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化。將PCR產(chǎn)物和表達載體pET-28a相同酶切后回收,連接,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Top10 中,提取質(zhì)粒,用酶切和測序鑒定重組質(zhì)粒。1.5 重組表達質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達

        將PK-28a-VIM質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(Rosetta)感受態(tài)細(xì)胞,挑取單菌落于濃度為100 μg/ml卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)12 h。將菌液和培養(yǎng)基以1∶ 100 接種于濃度為100 μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,于37℃ 振蕩培養(yǎng)至OD600值達到0.4~0.6時,加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG,分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后2、4、6 h收集菌液,12%分離膠進行SDS-PAGE檢測。

        1.6 重組蛋白的純化

        大量表達后收集細(xì)菌,PBS洗滌菌體3次后超聲菌體,5 000×g 離心10 min,用8 mol/L尿素溶解。12 000×g 離心30 min,收集上清,按Ni柱說明書純化蛋白。

        1.7 Western blot 鑒定

        將純化的蛋白進行SDS-PAGE 后,轉(zhuǎn)到PVDF(聚偏氟乙烯)膜上,2.5%脫脂乳4℃封閉過夜,加入1∶ 4 000稀釋的抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體室溫孵育1 h, PBST洗滌3次,每次5 min,加入1∶ 4 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗,室溫孵育1 h, PBST洗滌3次,DAB(增敏二氨基聯(lián)苯胺)顯色。

        1.8 抗波形蛋白抗體的制備

        選取3只成年健康的雌性新西蘭大白兔,1 mg/只對兔子背部皮下及足底注射免疫,首次免疫后第14天和第28天分別進行第2、3次免疫。首次免疫用弗氏完全佐劑,其余用弗氏不完全佐劑。每次免疫前對兔子進行耳緣靜脈取血備用。

        1.9 抗波形蛋白抗體檢測

        將4 μg/ml的波形蛋白100 μl包被于ELISA孔板中,將三免收集的兔血清倍比稀釋,用ELISA方法檢測抗體滴度。同時進行IFA(免疫熒光)檢測,將抗重組波形蛋白血清按1∶ 40、1∶ 80、1∶ 160、1∶ 320稀釋加入到單層PK-15細(xì)胞上,每孔加入100 μl,37℃孵育1 h。加入TRITC(四鉀基異硫氰酸羅丹明)標(biāo)記的羊抗兔二抗,37℃避光孵育1 h后鏡檢,用未免疫的兔血清作為陰性對照。

        1.10 波形蛋白的病毒阻斷檢測

        純化后的豬波形蛋白用尿素濃度梯度為8~2 mol/L、pH梯度為6.0~8.5的復(fù)性溶液于16℃條件下進行雙梯度透析復(fù)性,每個梯度透析12 h。將透析后含有2 mol/L尿素的5、10、50 μg波形蛋白分別與100 TCID50的PRRSV TA-12于37℃孵育1 h后,接種長成單層的Marc-145細(xì)胞,37℃感作1 h后棄上清,PBS洗滌3次;加入含有3%新生牛血清的DMEM,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;用-20℃預(yù)冷的75%乙醇4℃固定30 min;加入抗PRRSV N蛋白的單抗6D10,37℃孵育1 h后加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗,37℃孵育1 h后熒光顯微鏡下觀察。禽戊肝病毒ORF-3蛋白作為陰性對照。重復(fù)3次。

        1.11 抗波形蛋白抗體的病毒阻斷檢測

        將抗豬波形蛋白抗體按1∶ 10、1∶ 20、1∶ 40和1∶ 80稀釋后分別加到長成單層的Marc-145細(xì)胞上,37℃孵育1 h;棄上清,PBS洗滌3次,加入100 TCID50的PRRSV TA-12,感作1 h后加入含有3%新生牛血清的DMEM,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;拿出一塊細(xì)胞培養(yǎng)板用-20℃預(yù)冷的75%乙醇4℃固定30 min;加入抗PRRSV N蛋白的單抗6D10,37℃孵育1 h 后用PBS洗滌3次,每次5 min;再加入FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的羊抗鼠二抗,37℃孵育1 h,熒光顯微鏡下觀察。以未免疫的兔血清作為陰性對照。另一塊培養(yǎng)7天,觀察CPE(細(xì)胞病變效應(yīng))。重復(fù)3次。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 目的基因的擴增

        PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可見大小約為1 401 bp的特異性擴增片段,與預(yù)期大小相符。序列測定結(jié)果表明其與GenBank公布的非全長的野豬波形蛋白核苷酸序列同源性為99.1%,與牛波形蛋白核苷酸序列同源性為94.7%。

        2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

        重組載體PK-28a-VIM用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定,結(jié)果切出與目的片段大小一致的片段,序列測定結(jié)果完全正確。

        2.3 重組質(zhì)粒的表達及純化結(jié)果

        對使用IPTG誘導(dǎo)前后的樣品進行SDS-PAGE 分析,結(jié)果表明,重組菌在誘導(dǎo)后出現(xiàn)大小約為57 ku的蛋白條帶,大小與預(yù)期的蛋白分子質(zhì)量基本一致,誘導(dǎo)后6 h蛋白的表達量最高。將重組菌超聲破碎后進行SDS-PAGE分析,發(fā)現(xiàn)重組蛋白存在于菌體沉淀中,以包涵體形式存在。用8 mol/L尿素洗滌、溶解細(xì)胞沉淀,用Ni柱純化,得到了純度較高的目的蛋白(見圖3) 。

        2.4 Western blot 鑒定結(jié)果

        用鼠抗His標(biāo)簽單抗對純化的表達產(chǎn)物進行Western blot分析。結(jié)果顯示重組波形蛋白在大小約57 ku處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶2.5 抗波形蛋白抗體水平檢測結(jié)果

        用ELISA方法檢測制備的抗波形蛋白抗體,血清按照1∶ 105 稀釋時,其OD值仍達到0.518,P/N值>2.1。使用制備2.6 波形蛋白的病毒阻斷IFA檢測

        將不同量的波形蛋白與100 TCID50的PRRSV TA-12孵育后接種長成單層的Marc-145細(xì)胞,IFA檢測結(jié)果顯示,Marc-145細(xì)胞的細(xì)胞病變與對照組相比明顯降低,波形蛋白的量越大阻斷效果越明顯,但是不能完全阻斷。

        2.7 抗波形蛋白抗體的病毒阻斷IFA及CPE檢測

        用抗波形蛋白抗體對100個TCID50的PRRSV TA-12株進行病毒阻斷實驗,IFA檢測發(fā)現(xiàn)抗重組波形蛋白的陽性血清按照1∶ 10稀釋時未檢測到陽性細(xì)胞,而血清稀釋度在1∶ 20時陽性細(xì)胞較陰性血清顯著減少,血清稀釋度在1∶ 40

        橋粒相連,將細(xì)胞核和細(xì)胞器維持在特定的空間。它可以被多種蛋白激酶磷酸化,不同細(xì)胞表達的波形蛋白存在較大差異,可能與翻譯后的加工修飾有關(guān)。Kim等[13]對介導(dǎo)感染Marc-145細(xì)胞的受體進行了研究,證明了波形蛋白能夠與PRRSV結(jié)合,外源表達的重組波形蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)到PRRSV非易感細(xì)胞系BHK-21和CRFK中,使PRRSV非易感細(xì)胞獲得了易感性,從而表明波形蛋白是PRRSV 受體復(fù)合物的一部分。

        本實驗從PK-15細(xì)胞中擴增出豬波形蛋白,經(jīng)序列測定分析發(fā)現(xiàn)豬波形蛋白核苷酸序列與牛的同源性為94.7%,與人波形蛋白核苷酸序列的同源性為92.6%,與猴波形蛋白核苷酸序列的同源性為92.4%,與小家鼠波形蛋白核苷酸序列的同源性為90.4%。另外,本實驗采用的原核表達載體為pET-28a(+),帶有His Tag 的蛋白標(biāo)簽,可與目的基因融合表達。經(jīng)誘導(dǎo)高效表達出大小約為57 ku的蛋白條帶。通過Western blot鑒定,所表達的融合蛋白可與His單抗發(fā)生特異性結(jié)合,由此說明在大腸桿菌中成功表達了重組波形蛋白。透析后的重組波形蛋白與PRRSV孵育后感染Marc-145細(xì)胞,感染量明顯降低。利用純化的波形蛋白免疫兔子得到抗波形蛋白的多抗可阻斷PRRSV感染。有意思的是,PK-15是PRRSV的非易感細(xì)胞系,而抗PK-15細(xì)胞的波形蛋白的血清可以阻斷PRRSV感染,說明不同的細(xì)胞表達了相似的波形蛋白,PRRSV易感與非易感細(xì)胞之間波形蛋白主要差異可能與翻譯后的加工修飾有關(guān),其磷酸化可能與PRRSV對細(xì)胞的嚴(yán)格噬性有關(guān)。作為PRRSV非易感的PK-15細(xì)胞卻表達了能與PRRSV結(jié)合的波形蛋白,這對研究波形蛋白的結(jié)構(gòu)、功能以及在PRRSV入侵細(xì)胞過程中發(fā)揮的作用很有意義。同時,抗血清對PRRSV侵染細(xì)胞的阻斷作用為PRRS防控提供了一個新的切入途徑。

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