摘 要：為了研究波形蛋白在介導(dǎo)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染細胞過程中的作用，利用RT-PCR方法從PRRSV非易感細胞系豬腎細胞系PK-15細胞中擴增目的基因，克隆入pET-28a（+）載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）中進行誘導(dǎo)表達。表達的重組豬波形蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定和純化后免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。利用病毒抑制試驗檢測重組豬波形蛋白及多克隆抗體在PRRSV感染Marc-145細胞過程中的作用。結(jié)果表明，成功擴增豬波形蛋白基因并克隆入pET-28a載體，經(jīng)誘導(dǎo)后得到高效表達，純化后免疫兔子產(chǎn)生高價血清抗體（105）。病毒阻斷結(jié)果表明，豬波形蛋白及多克隆抗體均能阻斷PRRSV感染Marc-145細胞。 這為以波形蛋白為基礎(chǔ)的PRRSV 受體阻斷抑制劑的研究提供了實驗依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；波形蛋白；病毒抑制；受體阻斷

中圖分類號：Q939.91 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2012）10-0001-07

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）能引起豬繁殖與呼吸綜合征（ PRRS），俗稱豬藍耳病。臨床表現(xiàn)為母豬晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等繁殖障礙和各年齡豬群的呼吸道癥狀。該病于1996年在我國首次報道[1]，給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。

波形蛋白廣泛存在于間充質(zhì)細胞及中胚層來源的細胞中，主要與維持細胞及細胞器形態(tài)、參與有絲分裂和細胞分化、促進細胞粘附和移行、創(chuàng)傷愈合、信號傳導(dǎo)、移植免疫和細胞凋亡等有關(guān)[2～4]。波形蛋白除了穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)之外，還與其他的細胞骨架纖維一起參與許多病毒的侵入或感染過程，例如Ⅰ型皰疹病毒[5]、藍舌病毒[6]、非洲豬高熱病毒[7]、人的呼吸道合胞病毒[8]、痘病毒[9]、泰勒氏小鼠腦脊髓炎病毒[10]和日本腦炎病毒[11，12]等。

PRRSV通過細胞表面受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用感染易感細胞，從而在細胞內(nèi)完成其復(fù)制和包裝等過程，該過程涉及多種蛋白，波形蛋白為其中一種。2006年Kim等用North-Western blot方法從Marc-145細胞中檢測到與PRRSV 3′非翻譯區(qū)RNA結(jié)合的分子量為57 ku的蛋白[13]，并驗證該蛋白為波形蛋白。盡管波形蛋白在進化過程中是保守的，但在不同細胞內(nèi)其執(zhí)行的功能不同，在多種病毒感染過程中都有著重要作用。王偉偉等[14]研究證明PRRSV易感細胞系Marc-145來源的猴波形蛋白及其抗體能阻斷PRRSV感染Marc-145細胞。目前已知豬是PRRSV唯一自然宿主，而豬腎細胞系PK-15細胞卻是PRRSV的非易感細胞。為了進一步研究豬波形蛋白和猴波形蛋白的功能關(guān)系及其與PRRSV的關(guān)系，本研究從豬腎細胞系PK-15中擴增出波形蛋白基因，表達純化后制備抗體，檢測豬波形蛋白及其抗體對PRRSV感染Marc-145細胞的影響，為PRRSV致病機制及其受體阻斷抑制劑的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞與菌株

PRRSV分離株TA-12（GenBank登陸號：HQ416720）、PK-15細胞、pET-28a （+）表達載體、受體菌E.coli Top10、表達菌BL21（DE3）均由本實驗室保存，載體pMD18-T購自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

TRIZOL購自Invitrogen公司，HiFi ploymerase、dNTP、Ni-NTA Resin、DNA純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，T4連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ購自TaKaRa公司，異丙基-β-D-硫化半乳糖苷 （IPTG） 購自Promega公司，HRP標記的羊抗鼠IgG購自Jackson公司，His 單克隆抗體購自南京金斯瑞公司，抗PRRSV N蛋白單克隆抗體6D10由本實驗室制備保存。

1.3 目的基因的擴增和序列的測定

根據(jù)GenBank上公布的牛波形蛋白序列（序列號NM_173969.3），設(shè)計并合成一對引物，上游引物5′-CAGCCATGTCCACCAGG-3′，下游引物5′-GCTGGTAGTATTTTGCTGC-3′。提取PK-15細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃ 90 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后連接于pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞Top10中，提取質(zhì)粒，酶切、PCR鑒定后送上海生工測序。

1.4 重組質(zhì)粒PK-28a-VIM的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計合成一對引物，上游引物5′-ATAGGATCCATGTCCACCAGGACCGT -3′（帶有BamHⅠ識別位點），下游引物5′-CGCAAGCTTTTATTCCAGATCATCGTG -3′（帶有Hind Ⅲ識別位點）。以pMD18-T-VIM為模板進行擴增。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃ 90 s，30個循環(huán)； 72℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化。將PCR產(chǎn)物和表達載體pET-28a相同酶切后回收，連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞Top10 中，提取質(zhì)粒，用酶切和測序鑒定重組質(zhì)粒。1.5 重組表達質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達

將PK-28a-VIM質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（Rosetta）感受態(tài)細胞，挑取單菌落于濃度為100 μg/ml卡那霉素的LB 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h。將菌液和培養(yǎng)基以1∶ 100 接種于濃度為100 μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃ 振蕩培養(yǎng)至OD600值達到0.4～0.6時，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，分別于誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后2、4、6 h收集菌液，12%分離膠進行SDS-PAGE檢測。

1.6 重組蛋白的純化

大量表達后收集細菌，PBS洗滌菌體3次后超聲菌體，5 000×g 離心10 min，用8 mol/L尿素溶解。12 000×g 離心30 min，收集上清，按Ni柱說明書純化蛋白。

1.7 Western blot 鑒定

將純化的蛋白進行SDS-PAGE 后，轉(zhuǎn)到PVDF（聚偏氟乙烯）膜上，2.5%脫脂乳4℃封閉過夜，加入1∶ 4 000稀釋的抗His標簽鼠單克隆抗體室溫孵育1 h， PBST洗滌3次，每次5 min，加入1∶ 4 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗，室溫孵育1 h， PBST洗滌3次，DAB（增敏二氨基聯(lián)苯胺）顯色。

1.8 抗波形蛋白抗體的制備

選取3只成年健康的雌性新西蘭大白兔，1 mg/只對兔子背部皮下及足底注射免疫，首次免疫后第14天和第28天分別進行第2、3次免疫。首次免疫用弗氏完全佐劑，其余用弗氏不完全佐劑。每次免疫前對兔子進行耳緣靜脈取血備用。

1.9 抗波形蛋白抗體檢測

將4 μg/ml的波形蛋白100 μl包被于ELISA孔板中，將三免收集的兔血清倍比稀釋，用ELISA方法檢測抗體滴度。同時進行IFA（免疫熒光）檢測，將抗重組波形蛋白血清按1∶ 40、1∶ 80、1∶ 160、1∶ 320稀釋加入到單層PK-15細胞上，每孔加入100 μl，37℃孵育1 h。加入TRITC（四鉀基異硫氰酸羅丹明）標記的羊抗兔二抗，37℃避光孵育1 h后鏡檢，用未免疫的兔血清作為陰性對照。

1.10 波形蛋白的病毒阻斷檢測

純化后的豬波形蛋白用尿素濃度梯度為8～2 mol/L、pH梯度為6.0～8.5的復(fù)性溶液于16℃條件下進行雙梯度透析復(fù)性，每個梯度透析12 h。將透析后含有2 mol/L尿素的5、10、50 μg波形蛋白分別與100 TCID50的PRRSV TA-12于37℃孵育1 h后，接種長成單層的Marc-145細胞，37℃感作1 h后棄上清，PBS洗滌3次；加入含有3%新生牛血清的DMEM，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；用-20℃預(yù)冷的75%乙醇4℃固定30 min；加入抗PRRSV N蛋白的單抗6D10，37℃孵育1 h后加入FITC標記的羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h后熒光顯微鏡下觀察。禽戊肝病毒ORF-3蛋白作為陰性對照。重復(fù)3次。

1.11 抗波形蛋白抗體的病毒阻斷檢測

將抗豬波形蛋白抗體按1∶ 10、1∶ 20、1∶ 40和1∶ 80稀釋后分別加到長成單層的Marc-145細胞上，37℃孵育1 h；棄上清，PBS洗滌3次，加入100 TCID50的PRRSV TA-12，感作1 h后加入含有3%新生牛血清的DMEM，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；拿出一塊細胞培養(yǎng)板用-20℃預(yù)冷的75%乙醇4℃固定30 min；加入抗PRRSV N蛋白的單抗6D10，37℃孵育1 h 后用PBS洗滌3次，每次5 min；再加入FITC（異硫氰酸熒光素）標記的羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察。以未免疫的兔血清作為陰性對照。另一塊培養(yǎng)7天，觀察CPE（細胞病變效應(yīng)）。重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴增

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可見大小約為1 401 bp的特異性擴增片段，與預(yù)期大小相符。序列測定結(jié)果表明其與GenBank公布的非全長的野豬波形蛋白核苷酸序列同源性為99.1%，與牛波形蛋白核苷酸序列同源性為94.7%。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

重組載體PK-28a-VIM用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，結(jié)果切出與目的片段大小一致的片段，序列測定結(jié)果完全正確。

2.3 重組質(zhì)粒的表達及純化結(jié)果

對使用IPTG誘導(dǎo)前后的樣品進行SDS-PAGE 分析，結(jié)果表明，重組菌在誘導(dǎo)后出現(xiàn)大小約為57 ku的蛋白條帶，大小與預(yù)期的蛋白分子質(zhì)量基本一致，誘導(dǎo)后6 h蛋白的表達量最高。將重組菌超聲破碎后進行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)重組蛋白存在于菌體沉淀中，以包涵體形式存在。用8 mol/L尿素洗滌、溶解細胞沉淀，用Ni柱純化，得到了純度較高的目的蛋白（見圖3） 。

2.4 Western blot 鑒定結(jié)果

用鼠抗His標簽單抗對純化的表達產(chǎn)物進行Western blot分析。結(jié)果顯示重組波形蛋白在大小約57 ku處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶2.5 抗波形蛋白抗體水平檢測結(jié)果

用ELISA方法檢測制備的抗波形蛋白抗體，血清按照1∶ 105 稀釋時，其OD值仍達到0.518，P/N值>2.1。使用制備2.6 波形蛋白的病毒阻斷IFA檢測

將不同量的波形蛋白與100 TCID50的PRRSV TA-12孵育后接種長成單層的Marc-145細胞，IFA檢測結(jié)果顯示，Marc-145細胞的細胞病變與對照組相比明顯降低，波形蛋白的量越大阻斷效果越明顯，但是不能完全阻斷。

2.7 抗波形蛋白抗體的病毒阻斷IFA及CPE檢測

用抗波形蛋白抗體對100個TCID50的PRRSV TA-12株進行病毒阻斷實驗，IFA檢測發(fā)現(xiàn)抗重組波形蛋白的陽性血清按照1∶ 10稀釋時未檢測到陽性細胞，而血清稀釋度在1∶ 20時陽性細胞較陰性血清顯著減少，血清稀釋度在1∶ 40

橋粒相連，將細胞核和細胞器維持在特定的空間。它可以被多種蛋白激酶磷酸化，不同細胞表達的波形蛋白存在較大差異，可能與翻譯后的加工修飾有關(guān)。Kim等[13]對介導(dǎo)感染Marc-145細胞的受體進行了研究，證明了波形蛋白能夠與PRRSV結(jié)合，外源表達的重組波形蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)到PRRSV非易感細胞系BHK-21和CRFK中，使PRRSV非易感細胞獲得了易感性，從而表明波形蛋白是PRRSV 受體復(fù)合物的一部分。

本實驗從PK-15細胞中擴增出豬波形蛋白，經(jīng)序列測定分析發(fā)現(xiàn)豬波形蛋白核苷酸序列與牛的同源性為94.7%，與人波形蛋白核苷酸序列的同源性為92.6%，與猴波形蛋白核苷酸序列的同源性為92.4%，與小家鼠波形蛋白核苷酸序列的同源性為90.4%。另外，本實驗采用的原核表達載體為pET-28a（+），帶有His Tag 的蛋白標簽，可與目的基因融合表達。經(jīng)誘導(dǎo)高效表達出大小約為57 ku的蛋白條帶。通過Western blot鑒定，所表達的融合蛋白可與His單抗發(fā)生特異性結(jié)合，由此說明在大腸桿菌中成功表達了重組波形蛋白。透析后的重組波形蛋白與PRRSV孵育后感染Marc-145細胞，感染量明顯降低。利用純化的波形蛋白免疫兔子得到抗波形蛋白的多抗可阻斷PRRSV感染。有意思的是，PK-15是PRRSV的非易感細胞系，而抗PK-15細胞的波形蛋白的血清可以阻斷PRRSV感染，說明不同的細胞表達了相似的波形蛋白，PRRSV易感與非易感細胞之間波形蛋白主要差異可能與翻譯后的加工修飾有關(guān)，其磷酸化可能與PRRSV對細胞的嚴格噬性有關(guān)。作為PRRSV非易感的PK-15細胞卻表達了能與PRRSV結(jié)合的波形蛋白，這對研究波形蛋白的結(jié)構(gòu)、功能以及在PRRSV入侵細胞過程中發(fā)揮的作用很有意義。同時，抗血清對PRRSV侵染細胞的阻斷作用為PRRS防控提供了一個新的切入途徑。

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