劉雁麗，史 萍，夏 妍，王桂萍，陳亞華

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

丹皮為藥用牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）的干燥根皮，具有良好的藥用價(jià)值。鳳丹（P.suffruticosa‘Feng Dan’）是著名的藥用牡丹品種，產(chǎn)于安徽，亦稱瑤丹、西山丹或安徽丹，安徽銅陵鳳凰山的產(chǎn)品質(zhì)量最佳，即“鳳丹皮”，被奉為道地藥材。近年來(lái)，鳳丹被大量引種到各地，雖然鳳丹在不同區(qū)域的生長(zhǎng)狀況相似，但生物活性成分差異很大［1］。丹皮酚是丹皮中主要的藥效成分，在土壤Cu污染嚴(yán)重的地區(qū)（如鳳凰山1號(hào)尾礦區(qū)）出產(chǎn)的丹皮中丹皮酚的含量甚至高于非污染地區(qū)［2］。Cu是重金屬元素，也是植物必需的微量元素之一，但Cu過(guò)量將會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生極大的毒害作用，不僅抑制植物的生長(zhǎng)、影響植物對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)元素的吸收以及植物的光合作用和呼吸作用，而且破壞細(xì)胞的膜系統(tǒng)和酶代謝，使植物的遺傳效應(yīng)發(fā)生變化［3］。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［4-8］，丹皮酚可以降低膜透性，對(duì)氧自由基有直接清除作用；對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和低密度脂蛋白氧化修飾具有抑制作用，可以增強(qiáng)抗氧化物酶的活性，顯著降低NO含量和NOS活性；丹皮酚還具有類似于鈣通道阻遏劑的作用，可抑制細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，保護(hù)Ca2+-ATPase活性及抗自由基氧化的作用。質(zhì)膜 H+-ATPase是植物生命活動(dòng)過(guò)程中的主宰酶［9-10］，環(huán)境因子作用下植物質(zhì)膜H+-ATPase的活性變化及其調(diào)節(jié)在一定程度上能反映環(huán)境因子對(duì)植物造成傷害的原因，對(duì)揭示植物的抗逆機(jī)制有重要意義［11-13］，而Al和Cu等重金屬脅迫能減弱植物質(zhì)膜的H+-ATPase活性［14-15］。

為了解Cu脅迫對(duì)鳳丹幼苗根系生長(zhǎng)、丹皮酚含量的影響以及丹皮酚對(duì)Cu脅迫的作用，作者在Cu單一處理及Cu-丹皮酚磺酸鈉（SPS）復(fù)合處理?xiàng)l件下對(duì)鳳丹根長(zhǎng)、丹皮酚含量及Cu含量進(jìn)行了分析；并采用不連續(xù)密度梯度離心法提取鳳丹根細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜微囊，研究了Cu和丹皮酚磺酸鈉處理對(duì)鳳丹根質(zhì)膜和液泡膜H+-ATPase活性的影響，了解丹皮酚對(duì)Cu脅迫的緩解作用，以期為中藥鳳丹的生產(chǎn)以及丹皮酚生理活性的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試?guó)P丹種子由安徽銅陵新橋高科技農(nóng)業(yè)示范園提供，經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所徐迎春教授鑒定。鳳丹種子經(jīng)質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.1％的高錳酸鉀消毒后，按照體積比1∶3的比例與滅菌的黃沙混合，置于25℃培養(yǎng)箱中層積約30 d，待種子露白后轉(zhuǎn)移至4℃冰箱中低溫培養(yǎng)約40 d后供試。

1.2 幼苗脅迫處理及根長(zhǎng)、Cu和丹皮酚含量測(cè)定方法

1.2.1 脅迫處理方法 挑選生長(zhǎng)一致的鳳丹幼苗移入帶孔蓋板的塑料燒杯中，每杯4株；用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液（pH5.5）預(yù)培養(yǎng)，每3天更換1次營(yíng)養(yǎng)液，2周后進(jìn)行脅迫處理。共設(shè)置2組脅迫處理實(shí)驗(yàn)，處理時(shí)間均為28 d，處理液均用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液（pH5.5）配制，其中Cu均以CuSO4的形式加入，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，每3天更換1次處理液。預(yù)培養(yǎng)及脅迫處理期間保持全天通氣，白天氣溫22℃ ～28℃，夜間氣溫10℃～20℃。

1.2.1.1 Cu脅迫對(duì)幼苗根長(zhǎng)及根中Cu和丹皮酚含量的影響實(shí)驗(yàn) 設(shè)置5組處理：0（CK）、5、10、20和30μmol·L-1Cu，其中對(duì)照（0μmol·L-1Cu）為不添加CuSO4的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。分別于處理的第7天、第14天、第21天和第28天測(cè)量根系長(zhǎng)度；分別于處理的第14天和第28天取樣測(cè)定Cu和丹皮酚含量。

1.2.1.2 Cu單一和Cu與EGTA或SPS復(fù)合處理對(duì)根中Cu和丹皮酚含量的影響實(shí)驗(yàn) 共設(shè)置4組處理：0μmol·L-1Cu（CK）、10μmol·L-1Cu、10 μmol·L-1Cu-10μmol·L-1EGTA、10μmol·L-1Cu-10μmol·L-1SPS（丹皮酚磺酸鈉，sodium paeonol sulfonate），其中對(duì)照（0μmol·L-1Cu）為不添加CuSO4的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。分別于處理的第14天和第28天取樣測(cè)定Cu和丹皮酚含量。

1.2.2 根長(zhǎng)測(cè)定方法 用直尺測(cè)量各處理每株幼苗主根的長(zhǎng)度。

1.2.3 Cu和丹皮酚含量測(cè)定方法 將鳳丹幼苗根部剪下，用自來(lái)水沖洗3遍、去離子水沖洗1遍，吸干水分后置于80℃烘箱干燥，冷卻后研磨成粉末。精確稱取烘干的鳳丹根系樣品粉末0.2000 g，采用硝酸-高氯酸法［16］消解；用Jena AAS nov AA400火焰-原子吸收分光光度計(jì)（德國(guó)耶拿分析儀器股份公司）測(cè)定Cu含量，并采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)樣品（西紅柿葉片： SRM1573a，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所）進(jìn)行質(zhì)量控制，Cu回收率為93％～104％。

鳳丹幼苗根于40℃～50℃條件下烘干后，用瑪瑙研缽磨碎，過(guò)40目篩；參照文獻(xiàn)［17］的方法測(cè)定丹皮酚含量。

1.3 離體脅迫處理和膜微囊H+－ATPase活性測(cè)定方法

1.3.1 膜微囊制備和純化及純度檢測(cè) 隨機(jī)收集幼苗幼嫩的側(cè)根根尖組織，消毒后，用預(yù)冷（4℃）的去離子水沖洗3次，吸干表面水分后稱取50.00 g，參照姚秋菊等［18］的方法，用不連續(xù)密度梯度離心法提取根細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜微囊，經(jīng)純度檢測(cè)后用于離體脅迫處理。

參照Yan等［19］的方法檢測(cè)膜微囊純度。反應(yīng)液總體積0.5 mL，含2.5 mmol·L-1ATP、5 mmol·L-1MgSO4、100 mmol·L-1KCl和25 mmol·L-1Hepes-Tris（pH6.5）。在反應(yīng)體系中分別加入質(zhì)膜 H+-ATPase抑制劑Na3VO4（0.5 mmol·L-1）、液泡膜H+-ATPase抑制劑KNO3（50 mmol·L-1）、線粒體ATP水解酶抑制劑NaN3（1 mmol·L-1）和非特異性磷酸酶抑制劑Na2MoO4（1 mmol·L-1），根據(jù)不同抑制劑的敏感活性在總活性（不加抑制劑）中所占的比例換算膜微囊純度。所有測(cè)定實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.2 膜微囊的離體處理方法 共設(shè)置3組處理：0（CK）、5、10和20μmol·L-1Cu單一處理；0（CK）、0.1、0.2、0.5和1.0μmol·L-1SPS單一處理；10 μmol·L-1Cu-0μmol·L-1SPS、10μmol·L-1Cu-0.1 μmol·L-1SPS、10μmol·L-1Cu-0.2μmol·L-1SPS和10μmol·L-1Cu-0.5μmol·L-1SPS復(fù)合處理。其中，對(duì)照（0μmol·L-1Cu和0μmol·L-1SPS）為不添加CuSO4或SPS的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。用各處理液對(duì)膜微囊制劑進(jìn)行處理，3 d后取樣測(cè)定質(zhì)膜和液泡膜微囊的H+-ATPase活性。每處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.3.3 H+-ATPase活性測(cè)定 參照Cheng等［20］的方法測(cè)定質(zhì)膜H+-ATPase活性；參照何龍飛等［21］的方法測(cè)定液泡膜H+-ATPase活性。每次測(cè)定設(shè)3次重復(fù)，重復(fù)測(cè)定2～3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析和方差分析（P=0.05）。

2 結(jié)果和分析

2.1 Cu處理對(duì)鳳丹幼苗根長(zhǎng)及根系中Cu和丹皮酚含量的影響

2.1.1 對(duì)根長(zhǎng)的影響 用不同濃度Cu處理不同時(shí)間鳳丹幼苗根長(zhǎng)的變化見(jiàn)表1。由表1可以看出：用5μmol·L-1Cu處理7～28 d，對(duì)鳳丹幼苗的根長(zhǎng)略有促進(jìn)作用，但與對(duì)照的差異均不顯著（P＞0.05）。用30μmol·L-1Cu處理7～28 d，鳳丹幼苗根長(zhǎng)均最短，且根長(zhǎng)均顯著小于對(duì)照（P＜0.05）；而用10或20 μmol·L-1Cu處理21～28 d，鳳丹幼苗根長(zhǎng)總體上顯著低于對(duì)照?？傮w上看，隨Cu處理濃度的提高，鳳丹幼苗根長(zhǎng)逐漸減??；而隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，幼苗根長(zhǎng)逐漸增加，但低濃度處理組增加幅度大于高濃度處理組。

2.1.2 對(duì)根中Cu和丹皮酚含量的影響 根系是受重金屬影響最主要的部位，也是最敏感的部位。用不同濃度Cu處理不同時(shí)間鳳丹幼苗根中Cu和丹皮酚含量的變化見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)：隨著Cu濃度的提高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，鳳丹幼苗根系中Cu含量呈增加趨勢(shì)，各處理組的Cu含量均顯著高于對(duì)照，且各處理組間也有明顯差異。

隨Cu處理濃度的提高，處理14和28 d時(shí)幼苗根系中丹皮酚含量均呈低濃度條件下高于對(duì)照、高濃度條件下顯著低于對(duì)照的趨勢(shì)。經(jīng)5μmol·L-1Cu處理28 d，鳳丹幼苗根系中丹皮酚含量顯著高于對(duì)照；在Cu處理濃度大于5μmol·L-1的條件下，鳳丹幼苗根系中丹皮酚含量顯著降低，且隨Cu處理濃度提高降低幅度增大。經(jīng)0～20μmol·L-1Cu處理28 d，幼苗根系中丹皮酚含量均高于處理14 d；而用30μmol·L-1Cu處理28 d，幼苗根系中丹皮酚含量低于處理14 d。

表1 不同濃度Cu處理對(duì)鳳丹幼苗根長(zhǎng)的影響（±SE）1）Table1 Effect of Cu treatment with different concentrations on root length of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seed ling（±SE）1）

表1 不同濃度Cu處理對(duì)鳳丹幼苗根長(zhǎng)的影響（±SE）1）Table1 Effect of Cu treatment with different concentrations on root length of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seed ling（±SE）1）

1）同列中不同的小寫字母表示差異顯著（P=0.05）Different small letters in the same column indicate the significant difference（P=0.05）.

Cu濃度/μmol·L-1 Conc. of Cu不同處理時(shí)間的根長(zhǎng)/cm Root length at different treatment times7d 14 d 21 d 28 d0（CK）9.40±0.53a 11.83±1.35a 15.77±0.56ab 21.90±1.87a59.67±0.88a 12.50±1.06a 16.53±2.35a 22.20±1.72a10 9.73±1.25a 12.01±1.21a 14.57±1.75ab 18.13±2.48b20 8.90±0.85ab 10.70±1.30ab 13.10±2.15b 16.23±1.50b30 8.70±1.00b 10.00±1.20b 11.33±1.65c 12.50±1.86c

表2 不同濃度Cu處理對(duì)鳳丹幼苗根中Cu和丹皮酚含量的影響（±SE）1）Table2 Effect of Cu treatment with different concentrations on contents of Cu and paeonol in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seed ling（±SE）1）

表2 不同濃度Cu處理對(duì)鳳丹幼苗根中Cu和丹皮酚含量的影響（±SE）1）Table2 Effect of Cu treatment with different concentrations on contents of Cu and paeonol in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seed ling（±SE）1）

1）同列中不同的小寫字母表示差異顯著（P=0.05）Different small letters in the same column indicate the significant difference（P=0.05）.

Cu濃度/μmol·L-1 Conc. of Cu不同處理時(shí)間的Cu含量/mg·kg-1 Cu content at different treatment times14 d 28 d不同處理時(shí)間的丹皮酚含量/g·kg-1 Paeonol content at different treatment times14 d 28 d0（CK）20.02±1.11e 20.55±2.81e 0.34±0.05a 0.36±0.02b5485.57±48.43d 840.12±21.23d 0.39±0.01a 0.41±0.01a10 912.87±36.92c 1594.76±90.54c 0.25±0.01b 0.28±0.00c20 1395.76±46.21b 2099.23±42.14b 0.22±0.01b 0.23±0.02d30 1900.82±71.78a 2937.27±114.24a 0.21±0.01b 0.19±0.01e

2.2 Cu與EGTA或SPS復(fù)合處理對(duì)鳳丹幼苗根系中Cu 和丹皮酚含量的影響

經(jīng)Cu-EGTA和Cu-丹皮酚磺酸鈉（SPS）復(fù)合處理14和28 d后鳳丹幼苗根系中Cu和丹皮酚含量的變化見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)：經(jīng)10μmol·L-1Cu處理14和28 d后，幼苗根系中Cu含量均顯著高于對(duì)照。與之相比，用10μmol·L-1Cu-10μmol·L-1EGTA和10μmol·L-1Cu-10μmol·L-1SPS處理14和28 d后，幼苗根系中的 Cu含量均顯著降低。其中，10 μmol·L-1Cu-10μmol·L-1EGTA處理組根系中的Cu含量與對(duì)照無(wú)顯著差異；而10μmol·L-1Cu-10 μmol·L-1SPS處理組根系中的Cu含量則顯著高于對(duì)照。此外，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，不同處理組丹鳳幼苗根系中的Cu含量增加。

由表3還可見(jiàn)：用10μmol·L-1Cu處理14和28 d，鳳丹幼苗根系中丹皮酚含量均顯著低于對(duì)照。與之相比，用10μmol·L-1Cu-10μmol·L-1EGTA和10μmol·L-1Cu-10μmol·L-1SPS處理14和28 d后，鳳丹幼苗根系中的丹皮酚含量顯著增加。其中，10μmol·L-1Cu-10μmol·L-1EGTA處理組根系中的丹皮酚含量與對(duì)照無(wú)顯著差異；而10μmol·L-1Cu-10μmol·L-1SPS處理組根系中的丹皮酚含量均顯著高于對(duì)照。此外，隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，不同處理組鳳丹幼苗根系中丹皮酚呈增高趨勢(shì)。

2.3 Cu和SPS單一或復(fù)合處理對(duì)鳳丹幼苗根離體質(zhì)膜和液泡膜微囊H+－ATPase活性的影響

2.3.1 膜微囊純度檢測(cè)結(jié)果 膜微囊的純度以H+-ATPase專一性抑制劑對(duì)其活性抑制的強(qiáng)弱來(lái)判斷。質(zhì)膜、液泡膜和線粒體膜上H+-ATPase的專一性抑制劑分別為Na3VO4、KNO3和NaN3。檢測(cè)結(jié)果表明：鳳丹幼苗根質(zhì)膜微囊H+-ATPase活性被Na3VO4抑制了67％，而分別被KNO3和NaN3抑制了2.1％和1.7％；液泡膜微囊H+-ATPase活性被KNO3抑制了72％，而分別被Na3VO4和NaN3抑制了2.5％和1.5％。符合H+-ATPase活性測(cè)定的要求。

表3 Cu與EGTA或丹皮酚磺酸鈉（SPS）復(fù)合處理對(duì)鳳丹幼苗根系中Cu和丹皮酚含量的影響（±SE）1）Table3 Effect of comp lex treatment of Cu with EGTA or sodium paeonol sulfonate（SPS）on contents of Cu and paeonol in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seedling（±SE）1）

表3 Cu與EGTA或丹皮酚磺酸鈉（SPS）復(fù)合處理對(duì)鳳丹幼苗根系中Cu和丹皮酚含量的影響（±SE）1）Table3 Effect of comp lex treatment of Cu with EGTA or sodium paeonol sulfonate（SPS）on contents of Cu and paeonol in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seedling（±SE）1）

1）同列中不同的小寫字母表示差異顯著（P=0.05）Different small letters in the same column indicate the significant difference（P=0.05）.

處理Treatment不同處理時(shí)間的Cu含量/mg·kg-1 Cu content at different treatment times14 d 28 d不同處理時(shí)間的丹皮酚含量/g·kg-1 Paeonol content at different treatment times14 d 28 d0μmol·L-1 Cu（CK）29.89±37.42c 28.23±41.97c 0.31±0.01b 0.34±0.01b10μmol·L-1Cu 922.35±80.12a 1143.45±73.93a 0.26±0.01c 0.28±0.01c10μmol·L-1Cu-10μmol·L-1 EGTA 67.33±35.32c 72.45±26.02c 0.31±0.01b 0.33±0.01b10μmol·L-1 Cu-10μmol·L-1 SPS 500.56±82.23b 642.43±50.34b 0.35±0.01a 0.39±0.01a

2.3.2 Cu單一處理對(duì)膜微囊H+-ATPase活性的影響 經(jīng)不同濃度Cu處理3 d后鳳丹幼苗根離體質(zhì)膜和液泡膜微囊H+-ATPase的活性見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)：與對(duì)照相比，經(jīng)5、10和20μmol·L-1Cu處理后鳳丹根質(zhì)膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性降低，且隨Cu濃度的提高，對(duì)膜微囊H+-ATPase活性的抑制效應(yīng)越明顯。經(jīng)5、10和20μmol·L-1Cu處理，鳳丹幼苗根質(zhì)膜微囊H+-ATPase活性分別下降至對(duì)照的93.3％、82.1％和74.3％；而液泡膜微囊H+-ATPase活性分別下降至對(duì)照的96.5％、93.2％和69.9％。

表4 Cu單一處理對(duì)鳳丹幼苗根離體質(zhì)膜和液泡膜微囊H+－ATPase活性的影響（±SE）1）Table4 Effect of Cu single treatment on H+-ATPase activity of m icrocapsules in vitro of plasma membrane and tonoplast in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seedling（±SE）1）

表4 Cu單一處理對(duì)鳳丹幼苗根離體質(zhì)膜和液泡膜微囊H+－ATPase活性的影響（±SE）1）Table4 Effect of Cu single treatment on H+-ATPase activity of m icrocapsules in vitro of plasma membrane and tonoplast in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seedling（±SE）1）

1）同列中不同的小寫字母表示差異顯著（P=0.05）Different small letters in the same column indicate the significant difference（P=0.05）.

Cu濃度/μmol·L-1 Conc. of Cu微囊H+-ATPase活性/μmol·mg-1·h-1 H+-ATPase activity in microcapsules質(zhì)膜Plasmamembrane 液泡膜Tonoplast0（CK）26.08±2.03a 23.99±1.59a524.32±1.71ab 23.15±1.68ab10 21.41±1.12b 22.37±1.91ab20 19.39±1.01b 16.78±2.58b

2.3.3 SPS單一處理對(duì)膜微囊H+-ATPase活性的影響 經(jīng)不同濃度SPS處理3 d后鳳丹幼苗根質(zhì)膜和液泡膜微囊H+-ATPase的活性見(jiàn)表5。由表5可見(jiàn)：與對(duì)照相比，經(jīng)0.1、0.2、0.5和1.0μmol·L-1SPS處理后幼苗根系質(zhì)膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性或略增加或略降低，但差異均不顯著；總體上看，隨SPS濃度的增加，膜微囊H+-ATPase活性逐漸增加，其中，1.0μmol·L-1SPS處理組膜微囊H+-ATPase活性最高。

表5 丹皮酚磺酸鈉（SPS）單一處理對(duì)鳳丹幼苗根離體質(zhì)膜和液泡膜微囊H+－ATPase活性的影響（±SE）1）Table5 Effect of sodium paeonol sulfonate（SPS）single treatment on H+-ATPase activity of m icrocapsules in vitro of p lasma membrane and tonoplast in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seedling（± SE）1）

表5 丹皮酚磺酸鈉（SPS）單一處理對(duì)鳳丹幼苗根離體質(zhì)膜和液泡膜微囊H+－ATPase活性的影響（±SE）1）Table5 Effect of sodium paeonol sulfonate（SPS）single treatment on H+-ATPase activity of m icrocapsules in vitro of p lasma membrane and tonoplast in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seedling（± SE）1）

1）同列中不同的小寫字母表示差異顯著（P=0.05）Different small letters in the same column indicate the significant difference（P=0.05）.

SPS濃度/μmol·L-1 Conc. of SPS微囊H+-ATPase活性/μmol·mg-1·h-1 H+-ATPase activity in microcapsules質(zhì)膜Plasmamembrane 液泡膜Tonoplast0.0（CK）26.33±1.61a 23.99±1.61a0.1 26.48±1.79a 23.58±1.71a0.2 26.03±1.73a 23.83±1.61a0.5 27.00±2.23a 24.25±2.06a1.0 30.29±2.01a 24.89±1.45a

2.3.4 Cu-SPS復(fù)合處理對(duì)膜微囊H+-ATPase活性的影響 經(jīng)Cu-SPS復(fù)合處理3 d后鳳丹幼苗根質(zhì)膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性見(jiàn)表6。由表6可見(jiàn)：與不添加SPS的10μmol·L-1Cu處理組（對(duì)照）相比，10μmol·L-1Cu與0.1、0.2和0.5μmol·L-1SPS復(fù)合處理使鳳丹幼苗根質(zhì)膜微囊H+-ATPase活性分別提高了3.4％、16.2％和27.3％，且10μmol·L-1Cu-0.5μmol·L-1SPS復(fù)合處理組的質(zhì)膜微囊H+-ATPase活性顯著高于對(duì)照；而10μmol·L-1Cu與0.2和0.5μmol·L-1SPS復(fù)合處理組的液泡膜微囊H+-ATPase活性有所增加，但與對(duì)照差異不顯著。

上述結(jié)果說(shuō)明：在10μmol·L-1Cu脅迫條件下添加0.1～0.5μmol·L-1SPS總體上可以提高鳳丹幼苗根系膜微囊H+-ATPase活性，且對(duì)質(zhì)膜微囊H+-ATPase的保護(hù)作用大于對(duì)液泡膜微囊H+-ATPase的保護(hù)作用。

表6 Cu－丹皮酚磺酸鈉（SPS）復(fù)合處理對(duì)鳳丹幼苗根離體質(zhì)膜和液泡膜微囊H+－ATPase活性的影響（±SE）1）Table6 Effect of complex treatment of Cu with sodium paeonol sulfonate（SPS）on H+-ATPase activity in m icrocapsules in vitro of plasmamembrane and tonoplast in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seedling（±SE）1）

表6 Cu－丹皮酚磺酸鈉（SPS）復(fù)合處理對(duì)鳳丹幼苗根離體質(zhì)膜和液泡膜微囊H+－ATPase活性的影響（±SE）1）Table6 Effect of complex treatment of Cu with sodium paeonol sulfonate（SPS）on H+-ATPase activity in m icrocapsules in vitro of plasmamembrane and tonoplast in root of Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’seedling（±SE）1）

1）同列中不同的小寫字母表示差異顯著（P=0.05）Different small letters in the same column indicate the significant difference（P=0.05）.

濃度/μmol·L-1 Concentration Cu SPS微囊H+-ATPase活性/μmol·mg-1·h-1 H+-ATPase activity in microcapsules質(zhì)膜Plasmamembrane 液泡膜Tonoplast10 0.0 21.45±1.11b 22.36±1.63a10 0.1 22.15±1.32ab 21.87±0.97a10 0.2 24.88±1.79ab 23.72±2.15a10 0.5 27.21±1.88a 26.79±2.15a

3 討論和結(jié)論

在重金屬脅迫條件下，根長(zhǎng)可以作為評(píng)價(jià)植物對(duì)重金屬耐性的間接指標(biāo)［22］。當(dāng)培養(yǎng)液中重金屬元素的濃度大于4μmol·L-1時(shí)，雙穗雀稗（Paspalum distichum L.）和狗牙根〔Cynodon dactylon（L.）Pers.〕的根系生長(zhǎng)受到顯著抑制［23］。但適當(dāng)濃度的重金屬可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)：低濃度Cu（10μmol·L-1）可以刺激向日葵（Helianthus annuus L.）幼苗莖葉脯氨酸的合成并促進(jìn)其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)［24］；用50和100μmol·L-1Cu處理可促進(jìn) Cu超積累植物海州香薷（Elsholtzia splendens Nakaiex F.Maekawa）的生長(zhǎng)，并能增加根系的伸長(zhǎng)量和植株的干質(zhì)量［25］。本研究結(jié)果顯示：用5μmol·L-1Cu進(jìn)行處理，對(duì)鳳丹幼苗的根長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響；但Cu處理濃度大于5μmol·L-1，對(duì)鳳丹幼苗的根長(zhǎng)有抑制作用，且濃度越高抑制作用越明顯。

席玉英等［26］對(duì)矮牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.var.spontanea Rehd.）體內(nèi)無(wú)機(jī)元素的分布規(guī)律進(jìn)行了研究，認(rèn)為矮牡丹對(duì)必需元素Cu有較強(qiáng)的吸收富集能力。沈章軍等［27］對(duì)安徽銅陵鳳凰山銅尾礦牡丹種植基地土壤和牡丹中重金屬污染狀況進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：在牡丹種植地的土壤中，Cu含量與牡丹根皮中的Cu含量呈正相關(guān)，丹皮內(nèi)的Cu含量與丹齡之間的相關(guān)系數(shù)為0.842。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：低濃度Cu（5μmol·L-1）處理可以使鳳丹幼苗根系中丹皮酚含量增加，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)增加效果不變；而高濃度Cu（高于或等于10μmol·L-1）處理對(duì)丹皮酚的積累具有抑制效應(yīng)。

EDTA和EGTA是最常用的、也是目前研究較多的螯合劑，與重金屬均具有很強(qiáng)的結(jié)合能力。傳統(tǒng)理論認(rèn)為：植物對(duì)金屬離子的吸收主要取決于溶液中該離子游離態(tài)的活度大小［28］。在離子-螯合劑混合溶液中，只有自由離子才能被根系吸收，當(dāng)EDTA將重金屬離子由離子態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)轵蠎B(tài)時(shí)，自由離子活度下降，植物對(duì)重金屬的吸收減少，從而能夠緩解重金屬的生物毒性［29］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Cu單一脅迫處理相比，添加EGTA的復(fù)合處理可使鳳丹幼苗根系中Cu含量顯著降低，也證實(shí)了EGTA對(duì)Cu毒害具有一定的緩解作用。

酚類物質(zhì)在提高植物抵御重金屬脅迫的能力中具有重要作用［30］，可以通過(guò)與Cu等重金屬離子的結(jié)合降低重金屬對(duì)植物的脅迫作用［31］。Xu等［32-33］和Sillanp??［34］的體外合成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：丹皮酚可以與Cu（Ⅱ）離子形成復(fù)合物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：分別加入與Cu處理濃度相同的 EGTA或丹皮酚磺酸鈉（SPS），可以顯著降低鳳丹幼苗根系中的Cu含量，但SPS的降低效果較EGTA差。在溶液中丹皮酚可能與Cu結(jié)合，但結(jié)合能力低于EGTA，且形成的結(jié)合物不易被鳳丹幼苗根系吸收，從而使鳳丹幼苗根系中Cu含量降低。

質(zhì)膜H+-ATPase是質(zhì)膜上一種重要的功能蛋白，在植物細(xì)胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、生長(zhǎng)發(fā)育等方面具有重要作用，逆境脅迫往往導(dǎo)致植物細(xì)胞膜H+-ATPase活性的改變［11，13］。楊穎麗等［15］直接用 CuSO4處理小麥（Triticum aestivum L.）后檢測(cè)質(zhì)膜微囊H+-ATPase的活性變化，結(jié)果表明：50、100和200μmol·L-1CuSO4能夠抑制小麥質(zhì)膜H+-ATPase的活性，其作用具有濃度依賴性。作者檢測(cè)了Cu脅迫處理后丹鳳根離體膜微囊H+-ATPase活性的變化，結(jié)果表明：與對(duì)照相比，5、10和20μmol·L-1Cu處理均使幼苗根系離體質(zhì)膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性下降，且Cu濃度越高H+-ATPase活性降幅越大，表明5～20μmol·L-1Cu脅迫處理對(duì)鳳丹幼苗根系質(zhì)膜與液泡膜微囊 H+-ATPase活性具有抑制作用，且該抑制作用具有濃度依賴性。

丹皮酚可以降低膜透性［4］，且還具有類似于鈣通道阻遏劑（異博定）的作用，可抑制細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，保護(hù)Ca2+-ATPase活性［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：用0.1、0.2、0.5和1.0μmol·L-1的丹皮酚磺酸鈉（SPS）處理后，鳳丹幼苗根系離體質(zhì)膜和液泡膜微囊 H+-ATPase活性與對(duì)照無(wú)顯著差異；與10μmol·L-1Cu單一處理相比，添加SPS總體上可以使鳳丹幼苗根系離體質(zhì)膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性升高，即SPS可以提高Cu脅迫條件下鳳丹幼苗根系離體質(zhì)膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性，對(duì)Cu的抑制作用具有緩解作用。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)：隨Cu脅迫處理濃度的提高，鳳丹根系中的Cu含量顯著增加；適當(dāng)濃度的Cu處理對(duì)鳳丹幼苗根系生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響，還可使根系中丹皮酚含量有所增加；但較高濃度的Cu脅迫處理對(duì)鳳丹幼苗根系生長(zhǎng)有明顯的毒害作用，且對(duì)根系中丹皮酚的合成有一定的抑制作用，這種毒害和抑制作用具有濃度依賴性；在Cu脅迫條件下添加外源SPS以及EGTA，可以提高鳳丹根系中丹皮酚含量，顯著降低根系中的Cu含量，對(duì)鳳丹根系的Cu脅迫傷害具有一定的緩解作用。離體條件下，Cu單一處理對(duì)鳳丹根系質(zhì)膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性有明顯的抑制作用，但SPS單一處理對(duì)鳳丹根系質(zhì)膜和液泡膜微囊H+-ATPase活性則有一定的促進(jìn)作用；而Cu與SPS復(fù)合處理也能提高質(zhì)膜和液泡膜微囊H+-ATPase的活性，說(shuō)明添加外源丹皮酚磺酸鈉對(duì)Cu脅迫傷害具有一定的緩解效應(yīng)，這可能是鳳丹耐銅脅迫的機(jī)制之一。

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