[摘要] 目的 探討烏司他丁聯(lián)合利多卡因?qū)Υ笫蠓稳毖俟嘧p傷時(shí)腫瘤壞死因子α（TNF-α）的影響。 方法 將120只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組。分別測(cè)定大鼠肺組織TNF-α表達(dá)水平、肺組織W/D值、動(dòng)脈血?dú)夥治觥?結(jié)果 與I/R組比較，S組、U組、L組及L+U組肺組織TNF-α表達(dá)水平均明顯降低（P ＜ 0.01）；肺組織W/D值明顯降低（P ＜ 0.01）；動(dòng)脈血PaO2值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。 結(jié)論 烏司他丁聯(lián)合利多卡因?qū)Υ笫笕毖俟嘧⒓毙苑螕p傷具有良好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低肺組織TNF-α表達(dá)水平有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 再灌注損傷；利多卡因；烏司他??；腫瘤壞死因子α

[中圖分類號(hào)] R563 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2012）33-0024-03

Protective effects of ulinastatin combined with lidocaine on pulmonary ischemia reperfusion injury in rats

HUANG Zhigang GUO Guangwei CHANG Liang WEN Wen

Department of Cardiothoracic Surgery，the Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To explore the influence of ulinastatin combined with lidocaine on tumor necrosis factor alpha （TNF-α） on pulmonary， when the ischemia reperfusion injury occurred in rats. Methods A total of 120 Wistar rats were randomly divided into five groups. Measuring the level of rats lung tissue TNF-α expression， lung tissue W/D ratio、and arterial blood gas analysis. Results Compared with the I/R groups， S， U， L groups and L + U groups， the TNF-α expression levels were significantly lower（P ＜ 0.01）；Lung tissue W/D was significantly lower（P ＜ 0.01）；Arterial PaO2 values have statistically significant（P ＜ 0.01）. Conclusion Combining Lidocaine with ulinastatin administration has better protective effects on acute lung injury cased by ischemic reperfusion in rats， which probable mechanism is correlated with decreasing level of TNF-α.

[Key words] Reperfusion injury； Lidocaine； Ulinastatin； Tumor necrosis factor α

肺缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/R）損傷常發(fā)生在肺移植、體外循環(huán)手術(shù)等臨床情況下，造成肺缺血。重新灌注后，缺血引起的肺損傷不但不減輕，反而加重。進(jìn)一步減輕肺I/R損傷，改善患者預(yù)后，是目前有待解決的關(guān)鍵問題。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α在器官缺血再灌注損傷中具有關(guān)鍵作用。國內(nèi)外通過抑制TNF-α的過度生成，控制炎癥反應(yīng)的程度，抑制中性粒細(xì)胞的活化，從而達(dá)到器官保護(hù)的目的[1-3]。現(xiàn)在隨著人們對(duì)利多卡因[8]和烏司他丁[4]的深入研究，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谄鞴偃毖俟嘧p傷方面都可以通過抑制TNF-α的過度表達(dá)起到一定的器官保護(hù)作用。二者聯(lián)用在急性肺缺血再灌注損傷中是否具有協(xié)同抗炎作用，目前尚不清楚。本研究旨在探討急性肺缺血再灌注損傷中利多卡因聯(lián)合烏司他丁的保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1主要試劑

鹽酸利多卡因注射液（上海朝暉藥業(yè)有限公司），注射用烏司他?。◤V東天普生化醫(yī)藥股份有限公司），TNF-α抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），即用型SABC免疫組化染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2動(dòng)物分組與模型建立

參照改良的Eppinger方法建立在體大鼠肺缺血再灌注損傷模型，健康Wistar大鼠120只，體重220～290g，隨機(jī)分為5組，每組24只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉，氣管插管接呼吸機(jī)，機(jī)械通氣10 min后，經(jīng)左側(cè)第5肋間進(jìn)胸，固定開胸器后離斷左下肺韌帶然后游離左肺門，靜脈注射50U肝素 5 min后，用無創(chuàng)血管夾夾閉左肺門（包括左主支氣管、左肺動(dòng)、靜脈），關(guān)胸30 min后開放血管夾行再灌注。假手術(shù)組（S組）不予阻斷肺門；缺血再灌注組（I/R組）阻斷左肺門30 min，不給予藥物干預(yù)；烏司他丁治療組（U組）阻斷左肺門前給予50000U/kg烏司他??；利多卡因治療組（L組）阻斷左肺門之后立即給予4 mg/kg利多卡因；利多卡因聯(lián)合烏司他丁組（L+U組）阻斷左肺門前給予50000U/kg烏司他丁，阻斷左肺門之后立即給予4 mg/kg利多卡因。各組分別于再灌注30、60、120 min后處死大鼠留取左側(cè)肺組織進(jìn)行檢測(cè)。

1.3動(dòng)脈血?dú)夥治?/p>

各組大鼠處死前經(jīng)頸動(dòng)脈取血0.5 mL并用肝素抗凝，避免與空氣接觸，測(cè)定PaO2值，PaO2反應(yīng)組織供氧和氣體交換情況，是反應(yīng)肺功能的重要指標(biāo)。

1.4肺組織形態(tài)學(xué)觀察及肺組織濕/干（wet/dry，W/D）值的計(jì)算

大鼠處死后，立即留取左肺上半葉稱濕重（W）并記錄，然后置于60℃烘箱中，48h后稱干重（D），求得肺組織濕/干 （W/D） 值，肺組織W/D值反映肺組織水腫程度；留取左肺下半葉進(jìn)行肺組織病理學(xué)分析，將肺組織放入4%甲醛中固定，然后依次進(jìn)行脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色。光鏡下HE染色觀察肺組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.5肺組織中TNF-α表達(dá)水平的檢測(cè)

左肺下半葉進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，用免疫組化SABC法測(cè)定大鼠肺組織TNF-α表達(dá)水平的變化。以 PBS 替代一抗孵育作為陰性對(duì)照，DAB 顯色。以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標(biāo)準(zhǔn)，光學(xué)顯微鏡觀察 TNF-α蛋白表達(dá)、分布情況， 在顯微鏡下放大 400 倍，隨機(jī)選擇不重疊的 5 個(gè)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行處理，測(cè)定結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One Way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠PaO2的變化情況

I/R組PaO2值明顯降低，且隨著時(shí)間的延長PaO2值呈進(jìn)行性下降，相同時(shí)間點(diǎn)與I/R組對(duì)比，S組、L組、U組和L+U組的PaO2值明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）；相同時(shí)點(diǎn)L組與U組比較PaO2值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）；相同時(shí)點(diǎn)L+U組與L組或U組分別比較PaO2值明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的PaO2值變化（x±s，mmHg）

注：各時(shí)點(diǎn)各組與I/R組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）；相同時(shí)點(diǎn)L組與U組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P > 0.05）

2.2大鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察及肺濕/干質(zhì)量（wet/dry mass，W/D）值的計(jì)算

2.2.1肺組織大體改變 S組大鼠左側(cè)肺葉色澤、形態(tài)正常，表面無出血點(diǎn)，胸腔內(nèi)無滲出液；I/R組大鼠可見左側(cè)肺葉充血水腫，色澤暗紅，表面可見紫紅色斑塊且胸腔內(nèi)可見淡紅色滲出液；L組和U組大鼠左側(cè)肺葉輕度充血，表面呈淡粉紅色，局部肺葉表面可見暗紅色出血點(diǎn)，肺葉彈性良好，胸腔內(nèi)可見少量淡黃色稀薄滲出液；L+U組大鼠較上述改變更輕微。

2.2.2病理改變 S組大鼠肺組織未發(fā)現(xiàn)病理改變；I/R組大鼠肺組織可見明顯水腫、滲出液較多、腔內(nèi)可見紅細(xì)胞、毛細(xì)血管擴(kuò)張、淤血、炎性細(xì)胞浸潤；L組和U組大鼠肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張，淤血程度較I/R組輕，部分肺間質(zhì)及肺泡水腫，肺泡腔內(nèi)滲出物明顯減少，少量炎性細(xì)胞浸潤。L+U組大鼠改變更輕微。

2.2.3各組大鼠肺組織W/D值的比較 S組肺組織無明顯水腫，I/R組肺組織水腫嚴(yán)重，再灌注后I/R組中肺組織W/D值隨著再灌注時(shí)間的延長呈進(jìn)行性增加，相同時(shí)間點(diǎn)與I/R組對(duì)比，S組、L組、U組和L+U組的W/D值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01），相同時(shí)間點(diǎn)L組與U組W/D值比較無顯著差異（P > 0.05）；相同時(shí)點(diǎn)L+U組與L組或U組分別比較W/D值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。 見表2。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)的W/D值的變化（x±s，n = 8）

注：各時(shí)點(diǎn)各組與I/R組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01） ；相同時(shí)點(diǎn)L組與U組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

2.3采用免疫組化法對(duì)肺組織中TNF-α表達(dá)水平的檢測(cè)

S組（ 圖1）棕黃色染色顆粒僅很少地分布于肺泡上皮及炎性細(xì)胞的胞漿中；I/R組（ 圖2）棕黃色染色顆粒大量分布于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞及大量炎性細(xì)胞的胞漿中；L組（ 圖3）和U組（ 圖4）棕黃色染色顆粒較多的分布于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞及炎性細(xì)胞的胞漿中；與I/R組比較L+U組（圖5）棕黃色染色顆粒的分布明顯減少。

肺組織經(jīng)缺血再灌注后，與I/R組比較，S組、L組、U組和L+U組TNF-α的表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）；相同時(shí)間點(diǎn)L組與U組比較TNF-α的表達(dá)水平無顯著差異（P > 0.05）；相同時(shí)間點(diǎn)L+U組與L組或U組分別比較TNF-α的表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表3。

3 討論

TNF-α主要是由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，正常水平時(shí)參與抵抗細(xì)菌、病毒、寄生蟲，促進(jìn)組織修復(fù)，引起腫瘤細(xì)胞凋亡等。但是過多的TNF-α產(chǎn)生和釋放會(huì)破壞機(jī)體免疫平衡，使機(jī)體產(chǎn)生多種病理變化。肺缺血再灌注損傷使大量的巨噬細(xì)胞處于過度活化的狀態(tài)，于是釋放大量的TNF-α，引起白細(xì)胞滲出，并刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放IL-6和IL-8，還能誘導(dǎo)黏附分子的表達(dá)[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，通過減少缺血再灌注損傷組織中的TNF-α含量可以減輕組織損害的程度[6]。TNF-α是一個(gè)強(qiáng)有力的促炎性細(xì)胞因子，在肺移植模型中，利用TNF-α抗體被證明防止排斥移植肺，導(dǎo)致減少趨化，能顯著減少白細(xì)胞浸潤和肺缺血再灌注損傷[7]。因此，在肺缺血再灌注損傷中觀測(cè)TNF-α的表達(dá)水平，可能更好地反映缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)強(qiáng)弱及評(píng)價(jià)藥物治療效果。

利多卡因是臨床常用的局麻藥物，隨著人們對(duì)利多卡因的深入研究，發(fā)現(xiàn)它在器官缺血再灌注損傷方面可以起到一定的器官保護(hù)作用。石翊颯等[8]研究發(fā)現(xiàn)利多卡因預(yù)先給藥可通過抑制TNF-α的表達(dá)減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷。不同因素導(dǎo)致的肺損傷時(shí)應(yīng)用利多卡因后發(fā)現(xiàn)，可顯著減輕肺順應(yīng)性和動(dòng)脈血氧分壓的下降，同時(shí)抑制中性粒細(xì)胞向肺臟的遷移和抑制氧自由基的產(chǎn)生，抑制肺濕/干重的比值和支氣管肺泡灌洗液中IL-1、IL-8 和白蛋白的上升，從而減輕肺臟形態(tài)學(xué)損傷[9]。

烏司他?。║T）為尿胰蛋白酶抑制劑，是從人類新鮮尿液中分離純化得到的一種糖蛋白，是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，除了抑制以胰蛋白酶為主的多種酶活性以外．還有抗炎癥介質(zhì)作用。最近研究發(fā)現(xiàn)它在器官缺血再灌注損傷方面可以起到一定的器官保護(hù)作用。陳慶良等[4]研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁在心肌缺血再灌注中對(duì)TNF-α具有明顯的抑制作用，從而具有明顯的抗炎性反應(yīng)，起到心肌保護(hù)作用。馬立民等[10]發(fā)現(xiàn)，烏司他丁可以通過促進(jìn)內(nèi)源性IL-10的表達(dá)，抑制血漿可溶性細(xì)胞間粘附分子-1（sICAM-1）的釋放而起到抑制肺缺血再灌注損傷中炎癥反應(yīng)的作用，降低肺組織的通透性，減輕肺組織水腫和肺泡水腫。

本研究結(jié)果顯示，利多卡因和烏司他丁都能明顯降低肺組織中TNF-α水平， 明顯降低肺組織W/D值，明顯升高大鼠動(dòng)脈血PaO2值；聯(lián)合應(yīng)用效果較單用利多卡因或?yàn)跛舅∽饔酶鼜?qiáng)。結(jié)果提示利多卡因和烏司他丁聯(lián)合應(yīng)用可抑制炎癥介質(zhì)的過度釋放，改善微循環(huán)、組織灌注等，以保護(hù)受損傷的肺組織，但其聯(lián)合用藥的最佳劑量以及對(duì)在體肺臟的影響還需要進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2012-10-16）