[摘要] 本文通過在培養(yǎng)基上具體實驗，對17種保?。üδ埽┊a(chǎn)品進(jìn)行了方法學(xué)方面的驗證。深入研究保健（功能）食品微生物學(xué)在檢驗細(xì)菌、霉菌及酵母茵檢查方法方面的合理性。以此來探討目前我國微生物學(xué)驗證方法的合理性。

[關(guān)鍵詞] 微生物學(xué)檢驗；方法學(xué)驗證；中國藥典；食品安全

[中圖分類號] R446.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2012）33-0069-02

目前我國食品衛(wèi)生在保證保?。üδ埽┦称返陌踩矫妫毡椴捎玫氖俏⑸飳W(xué)檢驗，按照我國目前的食品衛(wèi)生管理條例[1]，我國保健食品衛(wèi)生應(yīng)該采用微生物學(xué)檢驗，因此，為了全面了解國標(biāo)（GB/T4789—2003）[2]方法驗證食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗是否具有合理性，研究人員依照《中國藥典》（2005年版）[3]微生物學(xué)驗證的相關(guān)要求入手研究，采用大腸桿菌和枯草桿菌在培養(yǎng)基里培養(yǎng)實驗并且采取微生物檢驗方法，對我國生產(chǎn)的一些保健食品進(jìn)行驗證，其中包括各種型號的口服液、藥丸、沖劑等等，來探討保?。üδ埽┦称沸l(wèi)生微生物學(xué)檢驗方法的重要性。通過幾種實驗的方法，有力地說明采用我國醫(yī)藥國家標(biāo)準(zhǔn)存在不完善的地方，同時對此提出一些合理的建議。

1 實驗材料

1.1 實驗樣品

牙周康膠囊、感冒軟膠囊、紳寧寶膠囊、天丹通絡(luò)膠囊、斯達(dá)舒膠囊、白伺丸膠囊、天然培旦陛牌70無蠟蜂膠液、復(fù)方蘆薈膠囊、清熱暗瘡膠囊、消炎靈膠囊、獨一味膠囊、糖尿樂膠囊、植物降糖膠囊、蝮蛇木瓜膠囊、坤復(fù)康膠囊、京都念慈庵靈芝蜜、頭孢地尼膠囊。

1.2 實驗用培養(yǎng)基

實驗用培養(yǎng)基包括酵母膏、葡萄糖培養(yǎng)基、高氏合成一號瓊脂、酵母膏、蛋白胨瓊脂、醋酸菌培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉汁瓊脂、固氮菌培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基、乳酸菌培養(yǎng)基Ⅱ、蛋白胨。

1.3 實驗用菌種

實驗用菌種包括大腸桿菌、沙門氏菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、福氏志賀氏和乙型溶血性鏈球菌。

2 實驗方法及結(jié)果

2.1 制備實驗用菌液

①先取在36℃環(huán)境中培養(yǎng)過的大腸桿菌、枯草桿菌、黑曲霉菌、福氏志賀氏肉湯培養(yǎng)物各3 mL，適當(dāng)加鹽水20 mL，以20倍稀釋至（100～200）cfu/mL，用作活菌計數(shù)使用[4]。②在26℃環(huán)境溫度培養(yǎng)19～23 h的白色念珠菌，再取其改良馬丁培養(yǎng)液2 mL，緩慢加鹽水20 mL，20倍稀釋到（100～200） cfu/mL，用作活菌計數(shù)使用。③在26℃環(huán)境溫度培養(yǎng)黑曲霉菌培養(yǎng)物1周左右，然后緩慢加鹽水4～5 mL，吸取出黑曲霉菌的菌液，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，當(dāng)菌液濁度一定時，再取2 mL適當(dāng)加鹽水20 mL逐管20倍稀釋至（100～200）cfu/mL，用作活菌計數(shù)來使用。

2.2 制備實驗用供試液

標(biāo)準(zhǔn)稱取樣品26 g，適當(dāng)添加0.15%的氯化鈉稀釋到230 mL，制成1∶10供試液。

2.3 驗證酵母菌和霉菌數(shù)計數(shù)方法

①采用常規(guī)法 取先前配好的1∶10的供試液2 mL，在培養(yǎng)基上分別接種6株菌株60～80 cfu，然后再加16～22 mL的瓊脂培養(yǎng)基，等供試液凝固后再放置到規(guī)定的條件下培養(yǎng)，然后記錄實驗結(jié)果并且計算菌株的回收率，回收率的計算公式為：S=（W-H）/D*100%。S為加菌回收率，W為實驗組的平均菌落數(shù)，H為供試品對照組的菌落數(shù)，D為液組的平均菌落數(shù)。②采用培養(yǎng)基稀釋法 每個容器加入供試液0.3 mL，然后接種試驗菌株60～80 cfu，過30 min再加上瓊脂培養(yǎng)基18～22 mL，等培養(yǎng)液凝固后將其放置在規(guī)定的環(huán)境下培養(yǎng)。然后記錄實驗結(jié)果并且計算菌株的回收率，菌株的回收率計算公式跟上面采用常規(guī)的方法一樣[5，6]。

2.4 驗證控制菌檢查方法

保健類食品通用標(biāo)準(zhǔn)（GB-16740）中明確規(guī)定：保健菌應(yīng)對大腸桿菌[CMCC（B）44102-22]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003-22]、溶血性鏈球菌[CMCC（B）32210-20]、志賀氏菌和沙門氏菌[CMCC（B）50094]等進(jìn)行檢驗。分別取≤100 cfu/mL的菌懸液1 mL加入相應(yīng)的檢驗對象的培養(yǎng)基中進(jìn)行陽性對照，同時應(yīng)設(shè)立不加有陽性菌的菌培養(yǎng)基作為實驗對照組與陰性菌作為對照，特別注意的是要對供試品進(jìn)行驗證檢驗，確保其對檢驗結(jié)果無任何影響[7]。

2.5 實驗結(jié)果分析

鑒于我國的保健食品微生物污染問題比較突出，而植物降糖膠囊按國標(biāo)的方法檢驗菌落數(shù)為0，但是采用薄膜稀釋卻為6000，檢測結(jié)果千差萬別，所以有些保健產(chǎn)品在控制菌檢查過程中存在漏檢、誤檢。這就充分說明了我國目前采用的方法驗證是不完善的。

2.6 實驗的注意事項

2.6.1 對檢驗人員的素質(zhì)要求 保健功能的食品微生物檢測的工作中充滿了實驗性，食品微生物檢驗工作中對儀器和設(shè)備的標(biāo)準(zhǔn)也是非常多的，同時儀器和設(shè)備的正常運行也是檢驗工作能夠順利完成的必備條件。因此工作人員在實驗室中的儀器設(shè)備進(jìn)行安裝、調(diào)試、檢驗和使用過程中都應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)章制度執(zhí)行，并確保所處環(huán)境符合要求。良好運行儀器和設(shè)備的同時還應(yīng)注意對其進(jìn)行保養(yǎng)，檢驗人員應(yīng)定期進(jìn)行檢查和維修，并在使用的過程中應(yīng)做好監(jiān)測、維修記錄，尤其要注意對儀器和設(shè)備的使用年期。

2.6.2 對儀器設(shè)備的要求 在食品微生物檢驗的過程中要保證所有藥品、試劑、培養(yǎng)基等符合要求，其藥品和試劑的純度必須在AR級以上，同時藥品和試劑的提供廠家必須具備專業(yè)素質(zhì)，確保藥品和試劑等符合相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，同時在儲存過程中應(yīng)注意防潮、防結(jié)塊等。

溶劑使用過程中應(yīng)注意：①溶劑的選取必須符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。②根據(jù)不同試劑的性質(zhì)不同，應(yīng)選擇不同的盛裝容器，對易揮發(fā)的試劑選擇的試劑瓶必須要帶塞，具有易分解性的試劑應(yīng)選用深色試劑瓶，其中棕色瓶最佳。③對變質(zhì)溶液應(yīng)立即停止使用。培養(yǎng)基在配制過程中應(yīng)注意：①必須在指定的容器中完成培養(yǎng)基制備工作。②培養(yǎng)基的配制過程中應(yīng)嚴(yán)格按照檢驗項目的規(guī)定進(jìn)行，不得隨意更改藥物的劑量。③配制培養(yǎng)基的水使用蒸餾水最佳。④配制培養(yǎng)基時應(yīng)注意對pH值的調(diào)整，不同微生物的pH值情況不同。⑤注意培養(yǎng)基的存放工作，溫室條件下的有效期為2周。⑥為了確保使用的培養(yǎng)基符合要求，在使用之前應(yīng)做無菌培養(yǎng)試驗和效果實驗。

3 保健食品微生物檢驗質(zhì)量及意義

目前，致命菌和微生物引起的安全問題被認(rèn)為是最重要的食品安全問題。據(jù)了解每年發(fā)生食物中毒的多達(dá)200萬人，主要由于食物不干凈或者食物中有害的微生物所導(dǎo)致的，因此對食品進(jìn)行微生物檢驗是十分必要的。

3.1 食品微生物檢驗內(nèi)容

食品微生物的檢驗主要是指對食品污染程度指示菌檢驗和食品中致病菌的檢測。其中污染程度的檢測主要是指食品及生活飲用水的污染程度，方法有兩種：①在一定條件下培養(yǎng)食品及飲用水的樣本，檢驗其含細(xì)菌菌落個數(shù)。②根據(jù)人類或畜生的糞便中的大腸桿菌在一定的存活環(huán)境，它能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)配、氧氣的革蘭染色陰性無芽孢桿菌，根據(jù)糞便污染指標(biāo)來評定生活食品及飲用水的衛(wèi)生質(zhì)量。食品中的致病菌包括金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌等，因此也應(yīng)明確該類微生物的數(shù)量[8]。

3.2 實驗設(shè)施及環(huán)境

無菌實驗室的建設(shè)應(yīng)符合GB19489的規(guī)定，特殊設(shè)備應(yīng)放置在特殊環(huán)境下，應(yīng)符合無回路的原則，在時間和空間上有效隔離各種檢測活動，確保檢測樣品的完整性，同時按操作規(guī)定程序應(yīng)采取預(yù)處理措施。

通過以下方法可以有效地減少污染：①紫外線消毒法：用220 V、30 W的紫外線燈垂直照射在1 m高度處，輻射強(qiáng)度應(yīng)高于70 μW/cm2，確保每立方米不少于1.5 W的紫外線光。②臭氧消毒法：在無人條件下，采用20 mg/m3濃度的臭氧作用30 min以上，使無菌室保持封閉狀態(tài)，在臭氧濃度≤0.2 mg/m2時再恢復(fù)作業(yè)。③物理方法：無菌室內(nèi)應(yīng)具有光滑的墻面、防滑地面并且墻、地、天花板間應(yīng)有弧度連接；避免人為差錯的出現(xiàn)；防止異物或有毒害物質(zhì)及微生物污染食品，實行全過程質(zhì)量監(jiān)控管理方式[9]。

3.3 生產(chǎn)過程中食品質(zhì)量的控制措施

①在食品生產(chǎn)過程中應(yīng)明確控制點、控制限值、監(jiān)控對象、錯誤補救措施，不斷摸索生產(chǎn)過程中的質(zhì)量和衛(wèi)生關(guān)鍵，將關(guān)鍵點做好記錄。②生產(chǎn)人員和機(jī)械設(shè)施應(yīng)具備對生產(chǎn)環(huán)境的適應(yīng)能力，準(zhǔn)確地控制生產(chǎn)過程中關(guān)鍵的環(huán)境溫、濕度和空氣凈化程度等指標(biāo)，適時進(jìn)行檢測并提供報告。③做好審核工作，產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)管部門應(yīng)對產(chǎn)品進(jìn)行抽查審核，對審核不合格的產(chǎn)品返工重新生產(chǎn)等。同時在生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的異常情況應(yīng)及時做好記錄并報告產(chǎn)品監(jiān)管部門，產(chǎn)品管理部門應(yīng)對不同的情況進(jìn)行必要的調(diào)查并記錄等處理。

3.4 保健食品微生物檢驗的意義

目前我國保健食品微生物中存在的污染問題日益顯著，我們曾經(jīng)對22中品種的保健品按照GB/T4789-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗方法進(jìn)行檢驗，發(fā)現(xiàn)不合格率已經(jīng)達(dá)到了10%以上。檢驗結(jié)果顯示出我國保健食品安全存在很大的問題，檢測過程中統(tǒng)計檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，主要存在菌數(shù)超標(biāo)、致病菌檢測不合格的現(xiàn)象。由此可知對保健食品產(chǎn)品的方法驗證是十分必要的[10]。

4 總結(jié)

通過以上實驗，采用傳統(tǒng)方法對菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)模擬保健食品的受微生物污染計數(shù)，可以得到以下結(jié)論：依據(jù)國家建議的保健食品衛(wèi)生微生物檢驗方法，與采用培養(yǎng)基稀釋法來對保健食品受微生物污染的檢測存在很大差別，這就是說目前我國采用的國家標(biāo)準(zhǔn)存在缺陷，從保健食品的安全考慮，應(yīng)該在食品生產(chǎn)最后階段添加一項確認(rèn)保健食品衛(wèi)生微生物檢驗方法的有效性工作，確保保健食品沒有受微生物污染，以此提高保健食品的質(zhì)量級別。

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（收稿日期：2012-10-15）