吳珺婷秦禮康金 毅鄧 婷閔方卿

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貞豐縣頂罈椒業(yè)有限公司，貴州 貞豐 562201）

水相酶解結(jié)合溶劑萃取生產(chǎn)花椒籽油工藝研究

吳珺婷1秦禮康1金 毅1鄧 婷1閔方卿2

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貞豐縣頂罈椒業(yè)有限公司，貴州 貞豐 562201）

采用水相酶解及有機(jī)溶劑萃取工藝生產(chǎn)花椒籽油。結(jié)果表明，得油率最高的優(yōu)化工藝參數(shù)：纖維素酶和中性蛋白酶添加量分別為0.5%和7%，固液比1∶5（m∶V），酶解時(shí)間4h。該法游離油得率最高可達(dá)69.84%，毛油品質(zhì)較好，有實(shí)際運(yùn)用價(jià)值。

花椒；花椒籽油；水酶法

頂壇花椒 （Zanthoxylum planispinumvar.dintanensis）是竹葉椒變種，廣泛栽培于貴州省貞豐縣北盤江喀斯特河谷地區(qū)，迄今已有數(shù)百年的栽培歷史，香味及口感獨(dú)特，以“香味濃、麻味重、產(chǎn)量高”而著稱［1，2］。頂壇花椒果實(shí)采收后，果皮常作烹飪調(diào)料和中藥配料，可制成上好的花椒油，余下的為黑色有光澤的花椒籽［3］，約占花椒果實(shí)總重量1/2，長期以來卻因無有效方式利用作為農(nóng)業(yè)廢棄物直接丟棄。經(jīng)分析，花椒籽中油脂含量為15%～27%，其脂肪酸組成中90%為不飽和脂肪酸，而人體必需脂肪酸亞油酸和亞麻酸含量達(dá)45%以上［4，5］。因此，花椒籽油是生產(chǎn)保健食用油的理想原料。

目前，花椒籽油的提取方法主要有壓榨法、溶劑浸出法及超臨界CO2萃?。?－8］等。水酶法提油工藝是一種新興的提油方法，該法以機(jī)械和酶解為手段降解植物細(xì)胞壁，使油脂得以釋放，達(dá)到提取油脂的目的。與傳統(tǒng)工藝相比，具有溫和的處理?xiàng)l件、所提取的油純度高、色澤淺、酸值及過氧化物值低、操作時(shí)能耗低、污染少等優(yōu)點(diǎn)。目前水酶法已應(yīng)用于多種油料的提?。?－12］，但對(duì)于以水酶法提取花椒籽油還未見相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)采用水相酶解有機(jī)溶劑萃取法生產(chǎn)花椒籽毛油，從生產(chǎn)工藝、油脂品質(zhì)及經(jīng)濟(jì)成本等三方面與超臨界CO2萃取法、螺旋壓榨法和液壓法進(jìn)行了比較，為進(jìn)一步提高花椒籽綜合利用及花椒籽油工藝改進(jìn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒籽：為貴州省貞豐縣北盤江喀斯特河谷地區(qū)成熟頂壇花椒，采摘后進(jìn)行殼籽分離，并于常溫避光保存。

堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶：南京龐博生物工程有限公司。

試驗(yàn)所用試劑：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE－5866A型，上海雅蓉生化設(shè)備儀器有限公司；

高速萬能粉碎機(jī)：FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：101A－2B型，上海錦昱科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

樣品→破碎→加入蒸餾水→沸水浴滅酶→冷卻調(diào)pH→加酶→水浴酶解→冷卻→破乳→3 500r/min離心10min→分離得上層液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→得油并記錄數(shù)據(jù)

1.3.2 原料制備 對(duì)花椒籽進(jìn)行自然晾曬、初選、粉碎（20目）、（80±1）℃烘干后（水分＜10%），于干燥器中冷卻，避光處室溫密閉貯藏備用。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用常規(guī)水酶法花椒籽酶解液進(jìn)行水油分離對(duì)比試驗(yàn)后，在相同加酶量下比較破碎方法、單一酶種與復(fù)合酶種對(duì)花椒籽游離油提取率的影響。為確定影響花椒籽籽游離油得率的主要因素，對(duì)酶種類及酶濃度、pH、固液比、酶解時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并以游離油得率為評(píng)定指標(biāo)。

1.4 分析測(cè)定方法

1.4.1 游離油得率 花椒籽游離油得油率按式（1）計(jì)算。

1.4.2 花椒籽品質(zhì)分析

（1）含油率：NY/T 1285——2007《油料種籽含油量的測(cè)定 殘余法》；

（2）水分及揮發(fā)物：GB/T 14489.1——2008《油料 水分及揮發(fā)物含量測(cè)定》；

（3）蛋白質(zhì)：GB/T 5009.5——2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；

（4）灰分：GB/T 5009.4——2003《食品中灰分的測(cè)定》；

（5）纖維素：GB/T 5515——2008《糧油檢驗(yàn) 糧食中粗纖維素含量測(cè)定 介質(zhì)過濾法》。

1.4.3 油脂品質(zhì)分析

（1）透明度、氣味、滋味檢驗(yàn)：SN/T 0801.9——1999《進(jìn)出口動(dòng)植物油脂 透明度、氣味、滋味檢驗(yàn)方法》；

（2）水分及揮發(fā)物檢驗(yàn)：GB/T 5528——2008《動(dòng)植物油脂 水分及揮發(fā)物含量測(cè)定》；

（3）不溶性雜質(zhì)檢驗(yàn)：GB/T 15688——2008《動(dòng)植物油脂 不溶性雜質(zhì)含量的測(cè)定》；

（4）酸值檢驗(yàn)：GB/T 5534——2008《動(dòng)植物油脂 酸值和酸度測(cè)定》；

（5）碘值檢驗(yàn)：GB/T 5532——2008《動(dòng)植物油脂 碘值的測(cè)定》；

（6）磷脂檢驗(yàn)：GB/T 5537——2008《糧油檢驗(yàn)：磷脂含量的測(cè)定》；

（7）皂化值檢驗(yàn)：GB/T 5534——2008《動(dòng)植物油脂 皂化值的測(cè)定》；

（8）維生素E檢驗(yàn)：NY/T 1598——2008《食用植物油中維生素E組分和含量的測(cè)定 高效液相色譜法》。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒籽品質(zhì)分析

由表1可知，本試驗(yàn)中所采用花椒籽含油率為16.05%，且花椒籽的纖維素和蛋白質(zhì)含量偏高，可以優(yōu)先選擇纖維素酶和蛋白質(zhì)酶進(jìn)行酶解試驗(yàn)。

表1 花椒籽品質(zhì)分析結(jié)果Table 1 Results of quality analysis pricklyash peel seed /%

2.2 花椒籽酶解液分離工藝改進(jìn)比較

篩選脫殼花椒籽經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后按一定固液比加入蒸餾水，85℃滅酶10min，冷卻至室溫后加入0.05mol/L檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)至酶最適pH值，勻成漿料后按一定的m（酶）∶m（籽）（干基計(jì)）加入酶制劑，50℃下酶解一定時(shí)間，破乳后3 000r/min離心后得到游離油、乳狀液、水解液及渣。

本試驗(yàn)以常規(guī)水酶法工藝酶解花椒籽后，酶解分離僅獲得少量油及大量乳狀液。乳狀液采用13 000g高速離心、超聲波、反復(fù)凍融法及調(diào)節(jié)pH值破乳，但均無法完成油水分離，故采用有機(jī)溶劑從酶解液中提取油脂。比較有機(jī)溶劑無水乙醇、無水乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯提取酶解液效果，由圖1可知，酶解乳狀液經(jīng)正己烷處理析出情況較好，游離油得率達(dá)到42.60%。

圖1 不同浸出溶劑提取花椒籽游離油得油率的比較Figure 1 The comparison of free oil yield ratio of pricklyash peel seed extracted by different solvent

選擇正己烷作為提油溶劑，通過反復(fù)的驗(yàn)證試驗(yàn)，確定了本試驗(yàn)水相酶解有機(jī)溶劑萃取工藝流程為篩選花椒籽，去除雜質(zhì)，粉碎（60目）后按固液比1∶4（m∶V）攪勻成漿，沸水浴1h滅酶，冷卻后調(diào)節(jié)至最適pH值，加酶后在水浴中50℃加熱酶解一定時(shí)間（120r/min攪拌）；冷卻后加入正己烷150mL繼續(xù)攪拌10min，3 500r/min離心10min，上層清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得毛油。

2.3 水酶法酶種及酶反應(yīng)條件的確定

2.3.1 花椒籽破碎方法對(duì)游離油得率的影響 油料的破碎方法分為干碾壓法和濕研磨法。一般而言，對(duì)于初始水分含量較高的油料種籽（如可可籽），常采用濕法破碎；對(duì)于花生，濕法破碎的結(jié)果是產(chǎn)生非常穩(wěn)定的乳狀液，從而影響游離油提取的工藝難度。由于花椒籽初始水分含量約為11%，采用干法破碎較為合適，這樣既可以減少能耗又可以在一定程度上避免破碎過程中形成穩(wěn)定的乳狀液。

2.3.2 酶的種類對(duì)得油率的影響 儲(chǔ)存在油料細(xì)胞內(nèi)部的油脂，通常同蛋白質(zhì)和碳水化合物等大分子結(jié)合，構(gòu)成如脂多糖、脂蛋白等復(fù)合體［13］。只有通過破壞油料組織的油脂復(fù)合體及細(xì)胞結(jié)構(gòu)，才能獲得其中的油脂。通過機(jī)械破碎，結(jié)合對(duì)油料組織以及脂多糖、脂蛋白等復(fù)合體有降解作用的酶處理油料的方法更易于提取植物油料中的油脂成分。酶能破壞細(xì)胞壁，對(duì)油料組織中的脂蛋白及脂多糖有分解作用，也可增加油料組織中油的流動(dòng)性達(dá)到提高出油率的目的。酶法提油中常采用的酶類主要有：纖維素酶（CE）、半纖維素酶（HE）、蛋白酶（PR）、果膠酶（PE）、α－聚半乳糖醛酸酶（α－PG）、α－淀粉酶（α－AM）、β－葡聚糖酶（β－GL）等［11］。

在固定酶反應(yīng)條件前提下，分別比較α－淀粉酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、纖維素酶在單一酶酶解花椒籽對(duì)游離油得率的影響。反應(yīng)條件為加酶量1%，固液比1∶6（m∶V），酶解溫度50℃，pH 7.0，時(shí)間4h，結(jié)果見圖2。由圖2可知，對(duì)比未添加酶試驗(yàn)，添加α－淀粉酶、菠蘿蛋白酶、果膠酶對(duì)花椒籽提油率沒有顯著影響。而酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、纖維素酶添加后游離油得率較其余3種酶增加明顯，其中纖維素酶的游離油得率為9.5%。

圖2 單一酶對(duì)花椒籽游離油得率的影響Figure 2 Effects of single enzyme on free oil yield ratio of pricklyash peel seed

2.4 復(fù)合酶條件對(duì)得油率的影響

一般情況下，復(fù)合酶系的作用效果優(yōu)于單一酶，油脂得油率會(huì)顯著提高［14］。單一的酶對(duì)提高游離油得率作用有限。試驗(yàn)將多種酶的單一使用效果和復(fù)合使用效果進(jìn)行對(duì)比，選取最適合于提取花椒籽油的酶的種類。參考文獻(xiàn)［15］，在前期大量預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用纖維素酶為主，復(fù)配其它蛋白酶的組合對(duì)花椒籽進(jìn)行水酶法提油試驗(yàn)。

2.4.1 中性蛋白酶和纖維素酶的復(fù)合效果 固定纖維素濃度為0.5%，分別添加5%的α－淀粉酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶，反應(yīng)條件為固液比1∶6（m∶V），酶解溫度50℃，時(shí)間4h，pH 7.0，結(jié)果見圖3。由圖2和圖3可知，添加復(fù)合酶能有效提高游離油得率。其中作用最明顯的是中性蛋白酶和纖維素酶，游離油得率達(dá)到50.39%。分析原因，花椒籽含有較多的蛋白質(zhì)和纖維素，這兩種酶的添加能夠有效地破壞細(xì)胞壁的纖維素及與脂類結(jié)合的蛋白結(jié)構(gòu)，從而充分的釋放細(xì)胞壁中的油脂。α－淀粉酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶與纖維素酶復(fù)合效果明顯低于其余3種酶，可能與花椒籽粉碎后的結(jié)構(gòu)有關(guān)，有待進(jìn)一步分析。

圖3 復(fù)合酶對(duì)花椒籽游離油得率的影響Figure 3 Effects of complex enzyme on free oil yield ratio of pricklyash peel seed

2.4.2 中性蛋白酶的濃度對(duì)游離油得率的影響 固定纖維素酶濃度為0.5%，增加中性蛋白酶濃度，反應(yīng)條件為固液比1∶6（m∶V），酶解溫度50 ℃，時(shí)間4h，pH 7.0，結(jié)果見圖4。

圖4 中性蛋白酶濃度對(duì)游離油得率的影響Figure 4 Effects of neutral protease concentration on free oil yield

由圖4可知，隨著酶濃度增加，游離油得率也逐漸增加。說明加酶量越大，蛋白質(zhì)的解離程度越徹底，油更易釋放。加酶量為1%～5%時(shí)，游離得油率緩慢上升，當(dāng)加酶量超過7%（V∶m）時(shí)，游離得油率增加緩慢，因此選擇中性蛋白酶濃度為7%（V∶m）。

2.4.3 纖維素酶的濃度對(duì)游離得油率的影響 固定中性蛋白酶濃度為7%，增加纖維素酶濃度，反應(yīng)條件為固液比1∶6（m∶V），酶解溫度50℃，時(shí)間4h，pH 7.0，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著纖維素酶濃度增加，游離油得率也逐漸增加。說明加酶量越大，纖維結(jié)構(gòu)被破壞的程度越徹底，油更易釋放。當(dāng)加酶量超0.5%（V∶m）時(shí)，游離油得率增加緩慢，因此選擇纖維素酶濃度為0.5%（V∶m）。

圖5 纖維素酶濃度對(duì)游離油得率的影響Figure 5 Effects of cellulose concentration on free oil yield

2.4.4 pH對(duì)游離油得率的影響 固定纖維素酶和中性蛋白酶加酶量，研究pH值變化對(duì)游離油得率的影響，反應(yīng)條件為纖維素酶0.5%，中性蛋白酶7%，固液比1∶6（m∶V），酶解溫度50℃，時(shí)間4h，結(jié)果見圖6。pH影響蛋白質(zhì)的溶解度，蛋白質(zhì)的溶出可提高游離油得率，為使蛋白酶能充分作用，必須通過提高pH值增大蛋白質(zhì)溶解量。本試驗(yàn)選用了纖維素酶和中性蛋白酶，根據(jù)所選酶的種類確定酶解時(shí)的pH，pH的選擇應(yīng)在酶的最適pH范圍內(nèi)，使酶和底物反應(yīng)充分。纖維素酶的最適pH值為3.8～7.0，中性蛋白酶的最適pH值為7.0～8.0。從圖6可看出，pH 7.0的游離油得率達(dá)到最大。

圖6 pH值對(duì)游離油得率的影響Figure 6 Effects of pH value on free oil yield

2.4.5 固液比對(duì)游離油得率的影響 固定下列條件，纖維素酶0.5%，中性蛋白酶7%，固液比1∶6（m∶V），酶解溫度50℃，時(shí)間4h，研究固液比對(duì)游離油得率的影響。由圖7可知，當(dāng)固液比為1∶5（m∶V）時(shí)游離油得率最高，表明在此條件下酶解最為充分。

圖7 固液比對(duì)游離油得率的影響Figure 7 Effects of solid－to－liquid ratio on free oil yield

2.4.6 酶解時(shí)間對(duì)游離油得率的影響 由圖8可知，酶解4h前，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，游離油得率明顯增加；4h后游離油得率增長緩慢。由于反應(yīng)時(shí)間過長會(huì)影響油的品質(zhì)，因此選定復(fù)合酶作用時(shí)間為4h。綜上所述，纖維素酶和中性蛋白酶的最適酶解條件：固液比為1∶5（m∶V），于50℃，pH 7.0下添加0.5%（V∶m）纖維素酶和7%中性蛋白酶（V∶m），酶解4h。

圖8 酶解時(shí)間對(duì)游離油得率的影響Figure 8 Effects of enzymolysis duration on free oil yield

目前水相酶解結(jié)合溶劑萃取制得花椒籽毛油的游離油得率最高可達(dá)69.84%（原料含油率16.05%）。通過以上試驗(yàn)，對(duì)制備花椒籽油的工藝條件有了初步研究，在本試驗(yàn)的下一階段工作中將對(duì)水相酶解結(jié)合溶劑萃取制備花椒籽油進(jìn)行工藝優(yōu)化研究。

2.5 不同方法制取毛油品質(zhì)的評(píng)價(jià)

在試驗(yàn)室采用水相酶解有機(jī)溶劑萃取法、超臨界CO2結(jié)合夾帶劑（無水乙醇）萃取法、螺旋榨油法、液壓榨油法分別以最優(yōu)條件［16］對(duì)花椒籽進(jìn)行壓榨制得毛油，并進(jìn)行油脂品質(zhì)分析與比較，結(jié)果見表2。

表2 不同方法制取花椒籽毛油各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)Table 2 Quality indexes of pricklyash peel seed oil based on various methods

超臨界CO2萃取法、水相酶解有機(jī)溶劑萃取法、液壓法3種工藝油碘價(jià)相差不大。僅超臨界CO2萃取油中檢出VE（0.13mg/100g）；同超臨界CO2萃取油相比，液壓法制得花椒籽油的酸價(jià)、過氧化值、皂化價(jià)和酸價(jià)偏高，其他品質(zhì)指標(biāo)均較接近，總體品質(zhì)較好。水相酶解有機(jī)溶劑萃取法的酸價(jià)、過氧化值和磷脂最高，皂化價(jià)偏低，有輕微溶劑殘留氣味，品質(zhì)較差。螺旋壓榨法提取油出油率極低，品質(zhì)最差，無法作為食用油使用。

3 結(jié)論

（1）高速離心、超聲波、反復(fù)凍融法及調(diào)節(jié)pH值法難以提取出花椒籽酶解液中的油脂。采用有機(jī)溶劑從酶解液中提取油脂，結(jié)果表明酶解液經(jīng)正己烷處理能完全析出，且所提油脂溶劑殘留較少，溶劑可回收重復(fù)使用。

（2）復(fù)合酶處理花椒籽提油效率優(yōu)于單一酶，選用纖維素酶＋中性蛋白酶酶解花椒籽結(jié)合溶劑萃取法提取花椒籽油高于其它組合。加酶量選擇纖維素酶（0.5%）和中性蛋白酶（7%）；固液比1∶5（m∶V）時(shí)得油率最高，表明在此條件下酶解最充分；經(jīng)篩選酶解時(shí)間為4h最佳。

（3）水相酶解有機(jī)溶劑萃取工藝流程：篩選花椒籽，去除雜質(zhì)，粉碎（60目）后按固液比1∶5（m∶V）攪勻成漿，沸水浴1h滅酶，冷卻后調(diào)節(jié)至酶最適pH值，加酶后在水浴中加熱酶解4h（120r/min攪拌）；冷卻后加入正己烷150mL繼續(xù)攪拌10min，3 500r/min離心10min，上層清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得毛油。

（4）超臨界CO2結(jié)合夾帶劑萃取青花椒籽油，食用品質(zhì)最佳，但成本較高，其工業(yè)應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)可行性低。水相酶解有機(jī)溶劑萃取毛油品質(zhì)較佳，游離油得率試驗(yàn)中最高可達(dá)69.84%（原料含油率16.05%），油脂品質(zhì)較優(yōu)，可進(jìn)一步改進(jìn)酶解能力、提油方法及后期精煉工藝以提高出油量和油質(zhì)，具有較大的改進(jìn)空間，對(duì)花椒籽制油及水酶法工藝研究具有一定的參考價(jià)值。

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Oil－producing technology of extractingZan thoxylum（pricklyash peel）seed oil by aqueous enzymatic extraction with solvent－extraction

WU Jun－ting1Qin Li－kang1JIN Yi1DENG Ting1MIN Fang－qing2

（1.College of Life Science University，Guiyang，Guizhou550025，China；2.Dingtan Pepper Industry Co.，Ltd，Zhenfeng，Guizhou562201，China）

Using from the organic solvent extract grease liquid of Huajiao seed from the enzymatic solution，the results showed that the enzyme solution were handled by hexane liquid could fully separate out，and proposed grease solvent residual less，solvent could be recycled.Composite enzyme treatment of Huajiao seed oil efficiency was superior to single enzyme.Considering the economic costs，plus enzyme quantity selection cellulose enzyme（0.5%）and neutral protease（7%）；Solid－liquid ratio to the highest rate when oil was 1∶5（m∶V），showed that in these conditions zymolysing most fully，and screening enzyme time for 4hbest.

Zanthoxylum planispinum（pricklyash peel）；Zanthoxylun bungeanumseed oil；enzymatic hydrolysis

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.033

國家科技部、財(cái)政部富民強(qiáng)縣專項(xiàng)行動(dòng)計(jì)劃（編號(hào)：H090034）

吳珺婷（1986－），女，貴州大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：foryoe＠126.com

秦禮康

2011－12－01