江媛媛劉 芳陳慶川李 濱許 丹

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.糧食深加工與品質(zhì)控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

農(nóng)藥檢測(cè)用植物酯酶的篩選及提取工藝優(yōu)化

江媛媛1，2劉 芳1，2陳慶川1，2李 濱1，2許 丹1，2

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.糧食深加工與品質(zhì)控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

從10種植物種子中提取植物酯酶，以總酯酶活力、比活力以及對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的靈敏性為指標(biāo)，篩選出最佳植物酯酶，并研究其最優(yōu)提取工藝。結(jié)果表明：大白豆的總酯酶活力和比活力均高于其它9種，對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性也較強(qiáng)；大白豆酯酶的最佳提取工藝為以0.04mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液為提取液，料液比1∶6（m∶V），攪拌提取90min。

植物酯酶；有機(jī)磷農(nóng)藥；總酯酶活力；大白豆

中國(guó)農(nóng)藥殘留超標(biāo)現(xiàn)象嚴(yán)重，部分地區(qū)農(nóng)藥殘留檢出率、超標(biāo)率高達(dá)31.68%和15.84%［1］。食用農(nóng)藥殘留超標(biāo)的農(nóng)副產(chǎn)品可能引起慢性中毒，導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。隨著人們健康意識(shí)的不斷增強(qiáng)，農(nóng)藥殘留檢測(cè)越來(lái)越受到關(guān)注。色譜法等傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法不適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，而植物酯酶抑制法由于取材方便、快速靈敏等優(yōu)點(diǎn)，適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。酶源的選擇是植物酯酶抑制法檢驗(yàn)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的基礎(chǔ)，現(xiàn)有的研究［2－7］顯示：小麥、黃豆、綠豆、花豇豆、刺槐種子、苜蓿等植物中總酯酶活力、比活力及對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的靈敏性較好。本試驗(yàn)在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，擴(kuò)大酶源篩選范圍，旨在選出更加適合有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)用的植物酯酶。并采用單因素和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法優(yōu)化大白豆植物酯酶的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大白豆、綠豆、黃豆、小麥仁、蕎麥仁、紅花蕓豆、黑蕓豆、白芝麻、橡石、薏仁米：市售；

氧化樂(lè)果、敵敵畏、敵百蟲(chóng)：市售；

α－萘酚、α－乙酸萘酯、固藍(lán)B鹽：分析純，廣州沃凱化工科技有限公司；

雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV－1800，日本島津公司；

高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：TGL－20M，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；

凱氏定氮儀：UDK142，意大利Velp公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶液的制備 稱取20g粉碎后的植物種子，加入0.04mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液120mL，攪拌90min，在4℃下靜置過(guò)夜，4層紗布過(guò)濾后，在10 000r/min下冷凍離心10min，上清液即為粗酶液。

1.2.2 α－萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確吸取1mmol/L的α－萘酚無(wú)水乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0，10，20，30，40，50，60，70，80μL，加磷酸緩沖溶液至4.5mL，混合均勻，加0.5mL固藍(lán)B鹽溶液，再次混合均勻，于30℃恒溫水浴顯色10min。以不加α－萘酚的溶液作對(duì)照，在595nm處測(cè)定吸光度。

1.2.3 總酯酶活力測(cè)定 參考文獻(xiàn)［8］、［9］所述方法測(cè)定植物酯酶總酯酶活力，略有改動(dòng)。操作過(guò)程：試管中依次加入緩沖液3.45mL，稀釋酶液1mL，16mmol/Lα－乙酸萘酯丙酮溶液50μL，混合均勻，在30℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)15min。然后加入0.5mL固藍(lán)B顯色劑，混合混勻，于30℃顯色10min。以不加α－乙酸萘酯的反應(yīng)液為對(duì)照，在595nm處測(cè)定吸光度，并根據(jù)式（1）計(jì)算總酯酶活力。將每分鐘催化得到1μmolα－萘酚所需的酶量定義為1U。

式中：

E—— 總酯酶活力，U/mL；

N——酶液的稀釋倍數(shù)；

K——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；

OD595——595nm處吸光度。

1.2.4 比活力的測(cè)定 根據(jù)GB 5009.5——2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，用凱氏定氮法測(cè)定粗酶液中蛋白質(zhì)含量，根據(jù)式（2）計(jì)算比活力：

1.2.5 農(nóng)藥敏感度測(cè)定 按照總酯酶活力的測(cè)定方法，檢測(cè)濃度均為5μg/mL的氧化樂(lè)果、敵敵畏、敵百蟲(chóng)對(duì)總酯酶活力相對(duì)較高的5中植物酯酶的抑制程度。選擇對(duì)農(nóng)藥抑制效果明顯的植物酯酶，測(cè)定不同濃度農(nóng)藥下的抑制率。抑制率按式（3）計(jì)算：

式中：

I—— 抑制率，%；

E未抑制——無(wú)有機(jī)磷農(nóng)藥抑制時(shí)的總酯酶活力，U/mL；

E抑制——某一濃度有機(jī)磷農(nóng)藥抑制時(shí)的總酯酶活力，U/mL。

1.2.6 提取工藝的優(yōu)化 用單因素試驗(yàn)的方法考察料液比、緩沖液濃度、緩沖液pH值、攪拌時(shí)間4個(gè)因素對(duì)大白豆酯酶提取效果的影響。

（1）稱取一定量粉碎后的大白豆種子，分別按1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8（m∶V）的料液比添加蒸餾水，攪拌相同時(shí)間后，靜置過(guò)夜，再用4層紗布過(guò)濾，在8 000r/min條件下，離心10min，收集上清夜，得粗酶液，稀釋一定倍數(shù)后按照1.2.3的方法測(cè)定總酯酶活力，以確定最佳料液比。

（2）在上述體系中，按料液比1∶5（m∶V）的比例，分別加入不同pH值（5.5～8.0）的磷酸緩沖液，以確定提取劑的最佳 pH值。

（3）在上述反應(yīng)體系中，按1∶5（m∶V）的料液，分別加入pH 值為7.0的不同濃度（0.02～0.12mol/L）的磷酸緩沖液，以確定磷酸緩沖液的最佳濃度。

（4）在上述反應(yīng)體系中，按1∶5（m∶V）的料液，加入pH值為7.0、濃度為0.04mol/L的磷酸緩沖液，攪拌提取不同時(shí)間（30～180min），以確定最佳攪拌時(shí)間。

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)4水平3因素正交試驗(yàn)，以確定最佳提取工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 α－萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

吸光度與α－萘酚濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。由圖1可知，決定系數(shù)達(dá)0.998 2，線性相關(guān)性良好，曲線斜率為75.708，根據(jù)總酯酶活力的計(jì)算公式，即可計(jì)算出植物酯酶的總酯酶活力。

圖1 α－萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 The standard curve ofα－naphthol

2.2 不同植物種子中總酯酶活力及比活力比較

10種植物種子中蛋白質(zhì)含量見(jiàn)表1。黑蕓豆、黃豆、紅花蕓豆、綠豆以及大白豆中蛋白質(zhì)含量較高，均超過(guò)20mg/mL。由圖2可知，總酯酶活力由大到小依次為大白豆＞綠豆＞黃豆＞黑蕓豆＞白芝麻＞蕎麥仁＞小麥＞紅花蕓豆＞薏仁米＞橡實(shí)；比活力由大到小依次為大白豆＞綠豆＞黃豆＞白芝麻＞蕎麥仁＞小麥＞黑蕓豆＞橡實(shí)＞薏仁米＞紅花蕓豆。大白豆酯酶總酯酶活力和比活力均為最高。

2.3 不同來(lái)源植物酯酶對(duì)農(nóng)藥的敏感性

根據(jù)總酯酶活力的測(cè)定結(jié)果，選擇總酯酶活力較高的5種植物種子，測(cè)定3種有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)其的抑制率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 不同植物種子中蛋白質(zhì)含量Table 1 Protein content in different plant seeds

圖2 不同植物種子中總酯酶活力及比活力Figure 2 Total esterase activity and specific activity of different plant seeds

表2 農(nóng)藥對(duì)不同植物酯酶的抑制率Table 2 The comparison of pesticides inhibition rate on different plant esterase /%

由表2可知，氧化樂(lè)果和敵百蟲(chóng)對(duì)大白豆酯酶的抑制率均為最高，敵敵畏則對(duì)黑蕓豆酯酶的抑制效果最明顯，其次是大白豆酯酶。

由圖3可知，3種有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)大白豆酯酶的抑制作用均隨農(nóng)藥濃度增加顯著加強(qiáng)，并呈線性關(guān)系。大白豆酯酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性較強(qiáng)。

圖3 3種有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)大白豆酯酶抑制率的比較Figure 3 The inhibition rate of 3kinds of organic phosphorus pesticides to large white beans esterase

2.4 大白豆酯酶最佳提取工藝

基于單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定了4個(gè)因素在3個(gè)水平上的正交試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表3。采用L9（34）的正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)，所得試驗(yàn)結(jié)果以總酯酶活力為指標(biāo)進(jìn)行極差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 因素水平表Table 3 Factor level table

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 4 Orthogonal experiment results and analysis

由表4可知，各因素對(duì)植物酯酶提取效果影響為緩沖液pH值＞料液比＞緩沖液濃度＞攪拌時(shí)間，最優(yōu)提取工藝為A2B2C3D3，即緩沖液pH值7.0，料液比1∶6（m∶V），緩沖液濃度0.04mol/L，攪拌時(shí)間60min。采用上述最優(yōu)提取條件重復(fù)試驗(yàn)3次，大白豆酯酶總酯酶活力的試驗(yàn)值分別為11.25，11.19，11.34U/mL，工藝重現(xiàn)性良好。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在酶源的選擇上秉承了現(xiàn)有的研究成果，以小麥、黃豆、綠豆等為原料，同時(shí)進(jìn)一步擴(kuò)大了酶源的篩選范圍，選擇富含蛋白質(zhì)和油脂的植物種子，如大白豆、橡實(shí)等。試驗(yàn)結(jié)果表明，大白豆酯酶由于活力高，且對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥敏感性強(qiáng)，可作為檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的新酶源。但是，對(duì)于不同品種、不同產(chǎn)地以及不同發(fā)育階段的大白豆，其酯酶活力及對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性是否存在顯著差異，需要進(jìn)一步研究。

為了提高對(duì)大白豆酯酶的提取效率，本研究利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法優(yōu)化了大白豆酯酶的提取工藝，得出最佳提取工藝為：以pH值7.0，濃度0.04mol/L的磷酸緩沖液為提取劑，按料液比1∶6（m∶V）的比例，攪拌提取60min。對(duì)大白豆酯酶提取條件的優(yōu)化有效提高了大白豆酯酶的提取效率，為了更有效地提高對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)靈敏度，還需要對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，明確其作用部位。

1 尹金鵬，柳挺.南陽(yáng)市蔬菜有機(jī)磷農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀調(diào)查分析［J］.衛(wèi)生職業(yè)教育，2010，28（10）：107～108.

2 李治祥，翟延路.應(yīng)用植物酯酶抑制技術(shù)測(cè)定蔬菜水果中農(nóng)藥殘留量［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，1987，7（4）：472～478.

3 溫艷霞，李建科.有機(jī)磷農(nóng)殘檢測(cè)用植物酯酶的研究［J］.食品科學(xué)，2006，27（4）：123～126.

4 林素英，林少琴，王軍，等.豆類酯酶的提取及其在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，15（9）：14～23.

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9 許學(xué)勤，徐斐，吳燕雯.固定化對(duì)動(dòng)植物酯酶性質(zhì)的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（7）：38～42.

Selection of phyto esterases used in pesticide residues detection and extraction process optimization

JIANG Yuan－yuan1，2LIU Fang1，2CHEN Qing－chuan1，2LI Bin1，2XU Dan1，2

（1.Central South University of Forestry and Technology，College of Food Science and Engineering，Changsha，Hunan410004，China；2.Key laboratory for the deeply processing and quality control of grain in Hunan，Changsha，Hunan410004，China）

Phyto esterases were extracted from 10different plant seeds，the total esterase activity，specific activity and the sensitivity to organophosphorus pesticides were compared and analyzed.Then the extraction process was studied.The results showed that：the esterase of large white beans had the highest total esterase activity and specific activity，and its sensitivity to organophosphate pesticides was also quite strong.The best extraction process conditions were：concentration of phosphate buffer solution 0.04mol/L pH7.0，ratio of solid－liquid 1∶6（m∶V），and time of stirring extraction 90min.

phytoesterase；organophosphate；total esterase activity；extraction process

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.018

江媛媛（1986－），女，中南林業(yè)科技大學(xué)在讀研究生。E－mail：jyy1000＠126.com

劉芳

2011－12－01