胡 亞，王冀邯，張曉天，王槐棟，趙春燕，王 放

（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130021）

銀花泌炎靈片對大腸埃希菌的抑菌機(jī)制

胡 亞，王冀邯，張曉天，王槐棟，趙春燕，王 放*

（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130021）

目的 檢測銀花泌炎靈片95%乙醇提取物對大腸埃希菌的體外抑菌活性；并通過繪制時間-殺菌曲線（KCs）探討其抑菌機(jī)理。方法 采用瓊脂稀釋法進(jìn)行大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922和20株泌尿系統(tǒng)感染者臨床分離株的體外抑菌活性研究，測定最小抑菌濃度（MIC）并繪制KCs。結(jié)果 銀花泌炎靈片95%乙醇提取物對大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離株都具有抑菌活性，MIC50-90均為50～100mg/mL；從繪制出的KCs可以看出：與對照組相比，銀花泌炎靈片95%乙醇提取物可以使細(xì)菌對數(shù)生長期延遲出現(xiàn)，并縮短細(xì)菌平臺期。結(jié)論 銀花泌炎靈片95%乙醇提取物對大腸埃希菌具有一定的抑菌活性，其初步抑菌機(jī)理可能與其延長細(xì)菌的分裂周期，抑制細(xì)菌的生長繁殖有關(guān)。

銀花泌炎靈片；大腸埃希菌；抑菌活性；最小抑菌濃度；抑菌機(jī)理

泌尿系統(tǒng)感染是臨床常見、多發(fā)的感染性疾病，病程頑固遷延，具有治療時間長、復(fù)發(fā)率高等特點。近年來隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致了臨床耐藥菌株的增加，使抗生素效率大大降低。因此，尋求治療泌尿系統(tǒng)感染的抗生素替代藥物迫在眉睫。我國中醫(yī)藥歷史悠久，研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中藥有清熱解毒、抗菌等作用[1-2]，具有相對安全、不良反應(yīng)小、價格低廉、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，在抗感染治療臨床應(yīng)用中存在巨大的開發(fā)潛力[3]。

銀花泌炎靈片是由金銀花、半枝蓮、扁蓄、瞿麥、石韋、川木通、車前子、淡竹葉、桑寄生、燈心草等組成的純中藥制劑，具有清熱解毒，利濕通淋的功效。臨床常用于治療急性腎盂腎炎，急性膀胱炎，下焦?jié)駸嶙C等泌尿系統(tǒng)感染，是目前臨床治療難治性泌尿系統(tǒng)感染的常用藥。然而，卻未見有關(guān)銀花泌炎靈片抑菌機(jī)制的研究。本研究通過KCs法探討“銀花泌炎靈片”對泌尿系統(tǒng)感染主要致病菌大腸埃希菌的初步抑菌機(jī)理，為其臨床應(yīng)用和推廣提供更堅實的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株：大腸埃希菌ATCC 25922，保存于吉林大學(xué)病原生物學(xué)教研室；20株大腸埃希菌臨床分離株：吉林大學(xué)第一醫(yī)院泌尿系統(tǒng)感染患者標(biāo)本中分離，經(jīng)本實驗室鑒定保存。

1.2 藥品

試驗藥物：銀花泌炎靈片95%乙醇提取物, 由吉林大學(xué)藥學(xué)院新藥研究室提供；對照藥物：雙黃連膠囊（河北奧星集團(tuán)藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z10980155，產(chǎn)品批號100520）。

1.3 主要試劑和儀器

M-H肉湯培養(yǎng)基（青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司；產(chǎn)品批號20100517）；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠，產(chǎn)品批號20111202）；生物安全柜（AIRTECH BHC-1300ⅡA/B）、紫外分光光度計（UNIC UV-2800AH）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DPX-9162B-1）。

1.4 藥物敏感性試驗

1.4.1 菌液制備 取出復(fù)蘇好的菌種，挑選1～2個典型的菌落接種于20 mL M-H肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37℃恒溫振搖3～4 h，此時生長濁度約為9×108cfu / mL，用M-H肉湯培養(yǎng)基稀釋為0.5麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)濃度的菌液備用。

1.4.2 瓊脂稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC）[4]配制藥物-營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基，使藥物的終濃度分別為200、100、50、25、12.5mg / mL。取100 uL 0.5麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)濃度的稀釋菌液涂布于平板表面，37℃培養(yǎng)18 h后，記錄MIC。

1.5 繪制時間-殺菌曲線（KCs）[5]

取無菌試管3支，每管加10 mL MH肉湯。第1管加入終濃度為100mg/mL銀花泌炎靈片95%乙醇提取物，第2管加入終濃度為100mg/mL雙黃連膠囊，第3管作為陰性對照。在各管中分別加入0.1 mL濃度為0.5麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)的待測菌液，使其終濃度為106cfu/mL 37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16 h，每2 h從各管取樣0.1 mL，加入到含有0.9 mL 0.9%的生理鹽水的試管中，編號為1，從中取出0.1 mL加入到另一含有0.9 mL生理鹽水的試管中，編號為2，以此類推，稀釋至第10管，其濃度依次為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10cfu / mL，分別從每只試管中取出0.1 mL菌液，均勻涂布于已滅菌的營養(yǎng)瓊脂平板上，每個濃度2個平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16～18 h，用肉眼進(jìn)行菌落計數(shù)，只計數(shù)菌落數(shù)在30～300個的平板，取其平均數(shù)，根據(jù)稀釋濃度計算原菌液的濃度。

2 結(jié)果

2.1 體外抑菌活性

銀花泌炎靈片95%乙醇提取物的MIC50-90為50～100mg/mL，陽性對照藥物雙黃連膠囊的MIC50-9050～100mg/mL?！般y花泌炎靈片”95%乙醇提取物對大腸埃希菌具有一定的抑菌活性，和陽性對照藥物雙黃連膠囊抑菌效果相當(dāng)。結(jié)果見表1。

表1 銀花泌炎靈片對大腸埃希菌體外抑菌結(jié)果

2.2 時間-殺菌曲線（KCs）結(jié)果

經(jīng)Orange 7.5軟件畫圖，時間-殺菌曲線（KCs）結(jié)果見圖1。由圖可見：與對照組相比，各實驗組均從0 h開始對大腸埃希菌ATCC 25922生長發(fā)揮抑制作用，大腸埃希菌的生長明顯受到抑制，菌體的生長處于較低的水平；對數(shù)期較正常菌延遲4 h左右出現(xiàn)，平臺期縮短，直接進(jìn)入衰退期。臨床株的時間-殺菌曲線（KCs）與ATCC 25922曲線圖形相似。

圖1 大腸埃希菌ATCC 25922時間-殺菌曲線（KCs）

3 討論

目前對于中藥抑菌機(jī)理方面的研究報道較少，有學(xué)者認(rèn)為抑菌中藥的可能抑菌機(jī)理為破壞細(xì)菌的新陳代謝，改變細(xì)菌細(xì)胞的通透性，氧化細(xì)菌體內(nèi)的活性基團(tuán)，破壞菌體蛋白或酶蛋白等[6]。但由于抑菌中藥多是復(fù)方制劑，抑菌活性可能是中藥中的多種單體成分通過多個抑菌途徑共同起作用的結(jié)果。因此，抑菌中藥對細(xì)菌分裂周期的影響至關(guān)重要。本研究旨在研究臨床常用抑菌中藥“銀花泌炎靈片”體外抑菌活性的基礎(chǔ)上，以KCs法繪制抑菌曲線，分析藥物對細(xì)菌分裂周期的影響，以初步揭示“銀花泌炎靈片”的抑菌機(jī)理。

本研究結(jié)果表明銀花泌炎靈片95%乙醇提取物對大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922和20株泌尿系統(tǒng)感染患者大腸埃希菌臨床分離株都具有一定的抑菌活性。KCs研究發(fā)現(xiàn)銀花泌炎靈片95%乙醇提取物延遲了大腸埃希菌的分裂時間，使大腸埃希菌生長周期中的對數(shù)生長期延長，并加速進(jìn)入衰退期，從而抑制了細(xì)菌的生長繁殖。由于該藥為中藥復(fù)方制劑，藥物中的單體化學(xué)成分眾多，具體是哪一種成分或幾種成分的聯(lián)合抑菌作用，還有待于進(jìn)一步研究。

[1]Almeida AA,Farah A,Silva DA,et al.Antibacterial activity of coffee extracts and selected coffee chemical compounds against enterobacteria[J].J Agric Food Chem,2006,54(23):8738.

[2]田應(yīng)彪,陳澤慧,楊名慧,等.16 種中藥水煎液對MRSA 和MSSA 體外抑菌試驗觀察[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2009,29 (11):897-899.

[3]陳澤慧,田應(yīng)彪,李丹丹,等.五味子,石榴皮等中藥對鮑曼不動桿菌體外的抑菌作用[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2011,31(15):1248-1251.

[4]Jyh-Ferng Yang,Cheng-Hong Yang,Hsueh-Wei Chang.Chemical Composition and Antibacterial Activities of Illicium verum Against Antibiotic-Resistant Pathogens[J].Journal of medicinal food,2010,13(5):1254-1262.

[5]Guoxing Liu,Jun-Chao Liang,Xue-Lin Wang.In Vitro Synergy of Biochanin A and Ciprofloxacin against Clinical Isolates of Staphylococcus aureus[J].molecules,2011(16):6656-6666.

[6]李 娟,李曉東,楊麗霞,等.單味中藥體外抑菌活性的研究進(jìn)展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2011,17(11):283-286.

Preliminary study of antibacterial mechanism of Yinhua Miyan Ling Tablet on Escherichia coli by KCs method

HU Ya, WANG Ji-han, ZHANG Xiao-tian, WANG Huai-dong, ZHAO Chun-yan, WANG Fang＊
(Norman Bethune College Medicine Jilin University,Changchun,Jilin 130021,China)

Yinhua Miyan Ling Tablet;E. coli; Antibacterial activity;Minimum inhibitory concentration;Antibacterial mechanism

R285

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2012.08.001.003.02

2012－03－02

胡 亞（1985－），女，碩士研究生，主要從事藥理學(xué)研究。

*王 放，男，副教授，吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院。

(本文編輯: 李新剛)