吳建力 杜華榮 尹耕心 吳玉鵬 傅克勤

安徽省計劃生育科學技術研究所(合肥，230031)

MLPA技術用于產前DMD基因診斷的應用探討

吳建力 杜華榮 尹耕心 吳玉鵬 傅克勤*

安徽省計劃生育科學技術研究所(合肥，230031)

假肥大性肌營養(yǎng)不良癥是一種嚴重的神經肌肉疾病，分為杜氏肌營養(yǎng)不良癥(DMD)和貝氏進行性肌營養(yǎng)不良癥 (BMD)，均是由于 DMD基因(Xp21.2)突變所致［1］。由于本病目前無有效的治療方法，產前診斷成為控制致病基因傳遞、防止患兒出生及降低發(fā)病率的主要措施。本研究對DMD產前診斷家系中具有高患病風險的2個胎兒，提取其羊水基因組DNA，采用多重連接探針擴增技術(MLPA)進行產前基因診斷的探索。

1 資料與方法

1 1 一般資料

2例均為進行DMD基因診斷，經MLPA技術確診為DMD基因外顯子缺失者，其母親再次妊娠，經超聲性別檢查胎兒均為男性，有50%患DMD風險，要求對胎兒進行DMD基因產前診斷。對標本的使用均知情同意。

1.2 方法

1.2.1基因組DNA提取采集2例患兒及父母外周靜脈血3～4ml至含EDTA抗凝劑的采血管中。抽取孕16～22周婦女羊水20ml，均使用基因組DNA提取試劑盒(QIAamp Blood DNA mini Kit)抽提DNA，加入適量的TE液，充分溶解DNA，紫外分光光度計測定DNA純度和濃度。將DNA濃度控制在50 ～200ng/μl，－20℃保存。

1.2.2 MLPA檢測MLPA檢測試劑盒 P034/P035購自MRC Holland。①基因組DNA變性和SALSA MLPA探針雜交:取約100ng(3μl)的基因組DNA，將其95℃變性5min，25℃保溫，然后向變性后的DNA中分別加入MLPA探針混合物和MLPA緩沖液，小心混勻，95℃ 孵育1 min，60℃過夜雜交15h以上。②連接反應:冷卻至54℃后，再加入連接緩沖液A、B和連接酶，小心混勻，54℃孵育15min，98℃加熱5 min終止連接反應，4℃保溫。③PCR反應:由SALSA FAM PCR引物、SALSA PCR緩沖液、水和SALSA聚合酶配制的SALSA PCR體系9.8μl中加入 2.7μl連接產物，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃60s，循環(huán)35次，72℃延伸20min。④毛細管電泳檢測:0.5μl PCR 產物與 0.15μl Genescan LIZ500 和10μl去離子甲酰胺混合，在ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer上經36cm毛細管電泳分離，溫度控制在60℃。3130 Data Collection Software(Applied Biosystems)收集數(shù)據，用GeneMapper ID v3.2軟件進行數(shù)據分析。每次MLPA檢測都包括一個正常的對照樣本，檢測結果均經過2次獨立的實驗證實。

2 結果

采用SALSA probe mix P034和P035兩套探針可同時檢測DMD基因79個外顯子缺失型和攜帶者。

2.1 家系1

見圖1、圖2。先證者(患病者)是DMD 45號外顯子缺失突變，母親為攜帶者:45號外顯子雜合缺失突變，胎兒為一正常男性胎兒。

2.2 家系2

見圖3，圖4。先證者是DMD 46～53號外顯子缺失突變，母親為DMD 45～53號外顯子雜合缺失突變，胎兒為一正常男性胎兒。

3 討論

假性肥大性肌營養(yǎng)不良為性染色體隱性遺傳。DMD患者一般有典型臨床表現(xiàn)和家族史，約1/3為散發(fā)型，男性患病，女性攜帶。BMD起病較晚，癥狀較輕且進展緩慢，多在16歲之后靠輪椅生活，壽命可達40～50歲。血清生化檢測是確定DMD/BMD攜帶者及患者的傳統(tǒng)方法，肌酶在疾病早期和進展期均明顯增高，尤以血清肌酸磷酸激酶最敏感。隨著分子生物學技術的發(fā)展，對疑似DMD進行準確的基因診斷可以避免誤診和誤治，給患者提供更加詳細準確的優(yōu)生優(yōu)育指導。

1868年Duchenne首次描述此病，同年Monaco等首次將DMD基因定位于Xp21.2，1987年Koenig等克隆了整個DMD基因約14kb的cDNA。DNA全長為2.4Mb，RNA 全長為 14.2Kb，含有 79 個外顯子，占X染色體全長的1.5%，包含79個外顯子和78 個內含子，是目前發(fā)現(xiàn)的人類最大的基因［2，3］。在DMD基因內存在許多重復序列，有許多斷裂和交換熱點，導致基因缺失/重復極容易發(fā)生新生突變。DMD基因具有突變長度不一、突變位置無固定規(guī)律等特點，突變無明顯種族、地理差異，突變中以外顯子缺失突變最常見(55% ～65%)［4］。

White等［5］2002年設計了多重可擴增探針雜交技術(MAPH)，同年 Schouten等［6］在 MAPH 技術的基礎上又發(fā)展了一種快速簡單的檢測技術，即MLPA。MLPA可以用2套引物通過2次 PCR檢測DMD基因79個外顯子缺失或重復，具有需要DNA量小、靈敏度高和重復檢測的優(yōu)點，是一種檢測DMD/BMD基因大片段缺失/重復的快速可靠方法，通過直觀圖譜進行檢測結果分析［7］。變性高效液相色譜(DHPLC)對DMD的基因缺失重復進行檢測，其他還可以利用高分辨溶解曲線、基因芯片、免疫組化等方法檢測DMD基因的突變類型［8］。

由于DMD涉及基因突變類型多，不同家系的突變類型可完全不同，需采用不同基因診斷方法和策略，因此在擬開展DMD的產前診斷之前必須首先完成家系中先證者的臨床確診和基因診斷，進行產前基因診斷才有意義。本所現(xiàn)階段僅對DMD外顯子缺失突變的先證者家系中具有髙致病風險的胎兒運用MLPA技術進行產前基因診斷。通常先運用MLPA技術檢測先證者及家系中其他患者的DMD基因所有外顯子，在明確存在DMD基因缺失型突變，確定缺失外顯子片段后，再對家系中的高風險致病胎兒進行針對同一片段的基因診斷。本文通過對2個家系的基因診斷，2個家系中的高致病風險胎兒檢測均未見DMD外顯子明顯缺失后，先證者母親繼續(xù)妊娠至胎兒分娩，取嬰兒血液經MLPA檢測證實與用羊水的檢測結果一致。嬰兒經產科及兒科醫(yī)生體檢，未見明顯異常臨床表現(xiàn)。進行血清酶學檢查及后期隨訪，也沒有發(fā)現(xiàn)異常臨床體征。如DMD外顯子篩查未發(fā)現(xiàn)缺失位點，則需開展先證者、先證者父母及家庭其他成員的DMD基因連鎖標志分析，確定家系突變DMD基因類型，而后建立相應的基因診斷技術［9，10］。這是本所下一階段爭取開展的項目研究，不僅可以降低發(fā)病率，而且可以檢測胎兒是否為基因攜帶者，從而有效控制致病基因的傳遞。

1 Francesco Muntoni，Silvia Torelli，Alessandra Ferlini，et al.Dystrophin and mutations:one gene，several proteins，multiple phenotypes［J］.The Lancet Neurology，2003，2(12):731 －740.

2 Monaco AP，Neve RL，Colletti－ Feener，et al.Isolation of candidate cDNAs for portions of the Duchenne muscular dystrophy gene ［J］.Nature，1986，(6089)323:646 －650.

3 Koenig M，Hoffman EP，Berteison CJ，et al.Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy(DMD)cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals［J］.Cell，1987，50(3):509 －517.

4 Mendell J R，Buzin CH，F(xiàn)eng J，et al.Diagnosis of Duchenne dystrophy by enhanced detection of small mutations［J］.Neurology，2001，57:645－650.

5 White S，Kalf M，Liu Q，et al.Comprehensive detection of genomic duplications and deletions in the DMD gene，by use of multiplex amplifiable probe hybridization［J］.The American journal of human genetic，2002，71(2):365 －368.

6 Schouten JP，McElgunn CJ，Wanijer R，et al.Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation－dependent probe amplification［J］.Nucleic Acids Resarch，2002，30(12):1 －13.

7 吳玉鵬，吳德，尹耕心，等.MLPA和PCR－RFLP技術用于脊髓性肌萎縮癥的基因診斷［J］.中國計劃生育學雜志，2008，16(9):535－539.

8 古艷，謝建生，韓春錫，等.應用多重連接依賴探針擴增技術對脊髓性肌萎縮患者及致病基因攜帶者進行基因診斷［J］.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2010，4(9):1512 －1519.

9 蒲祥元，金帆.Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥的植入前遺傳學診斷［J］.國際生殖健康/計劃生育雜志，2009，28(5):324 －325.

10 LI Q，Li SY，Hu DG，et al.Prenatal molecular diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophy［J］.北京大學學報(醫(yī)學版)，2006，38(1):53 －56.

2012－05－11

2012－07－06*

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［責任編輯:張 璐］