白 玲 謝 琦 佘尚揚(yáng) 夏紅衛(wèi) 劉永明，*

1.桂林醫(yī)學(xué)院(541004);2.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院

·技術(shù)與方法·

精子抗原肽的合成及其在酶聯(lián)免疫吸附法檢測抗精子抗體中的應(yīng)用價值

白 玲1謝 琦1佘尚揚(yáng)2夏紅衛(wèi)2劉永明1，*

1.桂林醫(yī)學(xué)院(541004);2.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院

目的:以合成精子抗原肽為抗原建立酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測抗精子抗體(AsAb)。方法:通過PS3全自動合成儀合成精子肽P10G、YLPl2和SP17抗原肽，經(jīng)反相高效液相色譜(HPLC)純化和質(zhì)譜鑒定，分別包板制備ELISA試劑盒，并檢測血清標(biāo)本。結(jié)果:成功合成3種目的肽，質(zhì)譜分析結(jié)果主峰分子量與理論值基本一致，HPLC結(jié)果顯示其純度為97.5%、97.78%和95.5%。以3種合成肽為抗原建立ELISA檢測AsAb，與商品化試劑盒比較，均顯示極好的一致性(Kappa值＞0.75)。結(jié)論:全自動固相多肽合成技術(shù)可用于高純度的精子抗原肽合成，所合成的P10G、YLPl2和SP17抗原肽均具有較好的抗原活性，可作為ELISA的包被抗原用于AsAb檢測。

精子抗原肽 抗精子抗體 固相多肽合成 酶聯(lián)免疫吸附測定法

不孕不育原因很多，其中2% ～10%與免疫因素有關(guān)［1，2］，9% ～36%的不孕癥夫婦存在抗精子抗體(AsAb)［3］。目前，血清中AsAb陽性已被列為人類免疫性不孕的確定指標(biāo)之一。建立一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的AsAb 檢測方法對臨床免疫性不孕癥的診斷和治療至關(guān)重要?，F(xiàn)常用的As-Ab檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。研究表明，合成肽能夠保持其生物活性及高度專一性的免疫原性［4］，故而研究應(yīng)用人工合成肽作為抗原制備試劑盒檢測抗體受到人們重視［5］。P10G(序列為PGGGTLPPSG)來自一個14kDa的兔精子自身抗原，O'Rand等［6］研究表明來自輸精管結(jié)扎術(shù)的男性和不孕婦女的血清可與合成肽P10G發(fā)生免疫反應(yīng)。YLP12(序列為YLPVGGLRRIGG)則是一段位于人類精子細(xì)胞頂體區(qū)域的肽序列，具有睪丸特異性，與人類精子和透明帶的識別和結(jié)合有關(guān)［7］。精子蛋白17(SP17)是一種哺乳動物睪丸、精子特異性抗原，主要功能是參與精子的頂體反應(yīng)，促進(jìn)受精過程［8，9］。對天然人 SP17 的模擬表位研究發(fā)現(xiàn):人SP17有兩個免疫優(yōu)勢的線性B細(xì)胞表位(4～19aa和118 ～127aa)［10］。本文選擇 118 ～127aa十肽序列(AVKIQAAFRG)作為SP17抗原肽進(jìn)行人工合成。筆者曾手工化學(xué)合成了P10G，并成功建立檢測AsAb的ELISA方法，具有較好的應(yīng)用前景［11］。在此基礎(chǔ)上，本文利用全自動固相多肽合成儀合成P10G、YLP12和SP17抗原肽，分別作為ELISA包被抗原檢測免疫性不孕患者血清AsAb，探討人工合成精子抗原肽作為包被抗原應(yīng)用于ELISA檢測AsAb的方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料

1.1.1肽合成主要試劑Rink amide－AM Resin、13種 Fmoc－氨基酸、哌啶、苯并三氮唑 － N，N，N＇，N＇－四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)均購自吉爾生化(上海)有限公司;N，N－二甲基甲酰胺(DMF)、N－甲基嗎啉(NMM)、三氟乙酸(TFA)、苯甲硫醚、苯甲醚購自比利時的ACROS公司;二巰基乙烷購自美國Sigma公司;乙腈購自Fisher Chemicals公司;乙醚、甲醇為國產(chǎn)分析純。

1.1.2血清標(biāo)本由廣西婦幼保健院檢驗科提供。

1.1.3 ELISA試劑酶標(biāo)板為美國Corning Costar 96孔板，包被液為0.05mol/L，pH9.6碳酸鹽緩沖液;封閉液為 0.01mol/L、pH7.4 磷酸鹽緩沖液(PBS)，內(nèi)含20%滅活新生牛血清;樣品稀釋液為含20%滅活新生牛血清，0.05%Tween－20的PBS;洗滌液為含0.05%Tween－20的PBS。酶標(biāo)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗人IgG，底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購自華美轉(zhuǎn)導(dǎo)科技有限公司。

1.2 主要儀器

PS3全自動固相多肽合成儀(Protein Technologies公司)，冷凍干燥機(jī)(Labconco公司)，多功能高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)，SPD－M20A型高效液相色譜儀(大連依利特有限公司)，酶標(biāo)儀(美國BioRad公司)。

1.3 方法

1.3.1精子抗原肽的固相合成、純化及鑒定在PS3全自動固相多肽合成儀上，以N－α－Fmoc保護(hù)的氨基酸為原料，Rink氨基樹脂為載體，HBTU為肽鍵縮合劑，采用固相多肽合成技術(shù)，從C端到N端按己知序列依次偶聯(lián)合成(圖1)。合成結(jié)束，取下反應(yīng)瓶，在通風(fēng)櫥中用DMF將反應(yīng)瓶中的肽－樹脂全部沖到Poly－Prep層析柱中，用甲醇沖洗樹脂除去DMF。氮?dú)獯蹈珊螅尤肓呀庖河谑覝叵抡袷幏磻?yīng)2h;反應(yīng)結(jié)束用離心管收集反應(yīng)液，氮?dú)庑⌒拇等シ磻?yīng)液中的TFA至反應(yīng)液余2ml左右。加入－20℃無水乙醚沉淀30min;離心收集沉淀;最后用氮?dú)獯等ヒ颐?，即得合成肽粗品。合成肽粗品?jīng)高效液相反相層析柱C18分離純化，收集主峰冷凍干燥后，得到反相高效液相色譜(RP－HPLC)純化的合成肽。對純化后的合成肽進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜(ESI－MS)鑒定，將質(zhì)譜分析的荷質(zhì)比與預(yù)測的理論分子量進(jìn)行比較。再經(jīng)RP－HPLC分析合成肽純度。

圖1 Fmoc固相多肽合成過程

1.3.2酶聯(lián)免疫吸附試劑盒的制備用包被緩沖液將精子抗原肽作系列稀釋，分別以1、5、10、20μg/ml的濃度包被酶標(biāo)板，經(jīng)棋盤方陣滴定法選擇包被抗原的工作濃度。將精子抗原肽稀釋至最適包被濃度，酶標(biāo)板每孔加入100μl，置4℃48h。洗滌3次。拍干后每孔加封閉液350μl，置4℃24h，洗滌5次。室溫干燥后封袋4℃保存。每孔加入100μl預(yù)先用樣品稀釋液稀釋100倍的血清標(biāo)本，置37℃水浴恒溫箱保溫1h，洗滌5次后甩干。每孔加入100μl工作濃度的酶標(biāo)抗體(羊抗人IgG－HRP)，置37℃水浴恒溫箱保溫1 h，洗滌5次后甩干。每孔加入100μl TMB底物溶液，置 37℃水浴恒溫箱保溫15min。最后每孔加入1mol/L H2SO450μl終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上(波長450nm)測定每孔的吸光度。臨界值為陰性對照平均值的2.1倍。

1.3.3血清標(biāo)本的檢測用上述方法自制的ELISA試劑盒檢測血清標(biāo)本，與南京欣迪生物藥業(yè)工程公司生產(chǎn)的抗精子抗體(IgG)ELISA檢測試劑盒的測定結(jié)果進(jìn)行對比。分別測定AsAb陽性血清40例，陰性血清50例。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Kappa系數(shù)作為兩種檢驗方法一致性的檢驗指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 精子抗原肽的純度分析和質(zhì)譜鑒定

純化后的精子抗原肽P10G、YLP12和SP17通過RP－HPLC分析，經(jīng)積分計算各主峰面積，純度分別為 97.5%、97.78% 和 95.5%(圖 2)，提示均為高度純化的合成肽，可以滿足ELISA實(shí)驗作為包被抗原的需要。ESI－MS法對純化后的P10G、YLP12和SP17抗原肽凍干品進(jìn)行分子量鑒定。ESI－MS分析顯示分子量分別為 836.99，1 255.69和1 060.60，與三者理論分子量(分別為 837.80、1 256.45和1 060.27)均相吻合(圖3)，證明純化后的合成產(chǎn)物為目的精子抗原肽。

2.2 ELISA試劑盒包被檢測條件

以合成的P10G、YLP12和SP17抗原肽分別作為包被抗原制備 ELISA試劑盒，檢測血清 AsAb(IgG)，經(jīng)棋盤方陣滴定法確定各抗原肽的最適包被濃度為5mg/L。

2.3 血清標(biāo)本檢測對照實(shí)驗

以南京欣迪生物藥業(yè)工程公司生產(chǎn)的AsAb(IgG)ELISA試劑盒的檢測結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)對照，測定結(jié)果及統(tǒng)計處理結(jié)果見表1。

P10G包被檢測特異性為100%，靈敏度為77.5%，兩種檢驗方法符合率為90%，Kappa值為0.79;YLP12包被檢測特異性為100%，靈敏度為75%，兩種檢驗方法符合率為89%，Kappa值為0.77;SP17抗原肽包被檢測特異性100%，靈敏度為85%，兩種檢驗方法符合率為93.3%，Kappa值為0.87。

表1 包被試劑盒與商品試劑盒測定結(jié)果的比較

3 討論

檢測AsAb是診斷免疫性不育癥及觀察其治療效果的常用方法，目前用于AsAb檢測的ELISA試劑盒通常是利用有正常生育能力者的精子直接提取抗原，或者普通合成肽抗原包被酶標(biāo)板，但其抗原來源受到限制，且穩(wěn)定性和重復(fù)性不理想;或者由于合成肽肽段比較短小，在包被過程中容易造成表位無法完全呈現(xiàn)，而影響檢出率，導(dǎo)致假陰性。于是一種易得、穩(wěn)定的精子抗原成為需要［12，13］。人工合成多肽抗原相比其他抗原成分明確，有較高的敏感性和特異性，而且制備簡單、快速，生產(chǎn)中不存在生物安全問題，還可以去除傳統(tǒng)抗原的毒性片段，提高抗原肽的安全性;或進(jìn)一步重組免疫增強(qiáng)序列以提高抗原性。人工合成肽作為ELISA試劑盒的包被抗原，因其分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、純度高而無其它蛋白成分，明顯提高檢出的特異性和敏感性而受到青睞，并且因其抗原成分明確，適于檢測試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化。

本文采用Fmoc法固相多肽自動合成技術(shù)，成功合成了P10G、YLP12和SP17特異性精子抗原肽，經(jīng)高效液相純化分析，純度高達(dá)97.5%、97.78%和95.5%;純化后的精子抗原肽經(jīng)ESI－MS分析，證明合成并純化所得的物質(zhì)為目的精子肽。用所合成精子肽P10G、YLP12和SP17抗原肽分別包被酶標(biāo)板，建立ELISA試劑盒檢測已知AsAb陽性、陰性血清標(biāo)本，與商品化的AaAb ELISA檢測試劑盒檢測結(jié)果比較，總符合率均大于或接近90%。Kappa值為0.79、0.77 和0.85，表明這兩種方法的檢驗結(jié)果具有極好的一致性。這說明所合成的3個肽段均有較好的抗原活性，可以以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步探索優(yōu)化檢測AaAb的ELISA試劑盒。

由于合成肽片段較短，且肽段的空間結(jié)構(gòu)與天然蛋白的空間結(jié)構(gòu)有可能不完全一致，多表現(xiàn)為線性表位，故對檢測的結(jié)果可能有一定的影響。如采用多個抗原肽混合包被而可以同時包含多個抗原表位，或進(jìn)一步與重組蛋白混合包被，可能會提高檢出率。本研究對以合成多肽為抗原的AaAb檢測ELISA法做了初步探討，對AsAb檢測方法的改進(jìn)和包被用抗原的標(biāo)準(zhǔn)化有重要意義，可以進(jìn)一步篩選出更高敏感性抗原肽段或肽段組合作為檢測用抗原，以提高檢測的敏感性，滿足臨床檢驗需求。

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Synthesis of sperm antigen peptides and its application in detection of antisperm－antibodies

Bai Ling1，Xie Qi1，She Shangyang2，Xia Hongwei2，Liu Yongming1，*
1.Guilin Medical University，Guilin541004;2.Maternal and Child Health Hospital of GuangxiCorresponding author:Liu Yongming，E－mail:liuym@glmc.edu.cn

Objective:To synthesize sperm peptides for establishment of the enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)to detect antisperm－antibodies(AsAb).Methods:The sperm peptide P10G，YLPl2 and SP17 were synthesized by the PS3 automated solid phase peptide synthesizer，purified by RP－HPLC and identified by mass spectrum(MS).With the synthetic peptide as a coating antigen，the ELISA method was used to detect serum concentration of AsAb.Results:The molecular weights of three synthesize peptides identified by MS were in good agreement with calculated molecular weights.The purity of the synthetic peptides purified by HPLC was 97.5%，97.78%and 95.5%.AsAb was detected by the indirect ELISA based on the peptide compared with the commercial kit，and results showed that both assays were unanimous with Kappa value more than 0.75.Conclusion:Automated solid －phase peptide synthesis could be used to synthesize high purity sperm antigen peptides.The synthesized peptide P10G，YLPl2 and SP17 show high antigenic activities and can be used as a coating antigen for indirect ELISA to detect AsAb.

Sperm antigen peptide;Antisperm－antibody;Solid－phase peptide synthesis;Enzyme－linked immunosorbent assay

10.3969/j.issn.1004 －8189.2012.08

廣西壯族自治區(qū)科技廳科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)項目(桂科攻0632007－1I)

2011－11－04

2012－01－28

*通訊作者:liuym@glmc.edu.cn

［責(zé)任編輯:張 璐］