張美玲，趙新淮

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱，150030)

天然蛋白質(zhì)沒有展示出食品工業(yè)所需要的性質(zhì)，經(jīng)過特定的修飾會改變其相應(yīng)性質(zhì)［1］，酶水解通常被用來提高蛋白質(zhì)的功能性及營養(yǎng)性［2］。來自植物或者動物蛋白的活性肽除了能作為正常營養(yǎng)品，還具有調(diào)節(jié)功效［3］。大豆蛋白是潛在的活性肽的來源，研究表明，大豆肽展示了許多生物活性:如降血壓性，抗氧化性等［4］。Decker證實一些肽段在螯合過度金屬離子(亞鐵離子和銅離子)方面有重要作用，提高礦物質(zhì)的生物利用率，有助于促進身體健康［5］。

類蛋白反應(yīng)是蛋白質(zhì)經(jīng)過酶水解后，發(fā)生縮合作用和轉(zhuǎn)肽作用，會產(chǎn)生原水解物中不存在的新肽段，就有可能改變其生物活性［6］。之前的研究表明，水相中類蛋白反應(yīng)能提高大豆蛋白水解物的功能性［7］，但在別的介質(zhì)中是否產(chǎn)生同樣的效應(yīng)尚不清楚。為此，本研究利用類蛋白反應(yīng)在乙醇-水相中對大豆蛋白水解物進行酶法修飾，采用響應(yīng)面法優(yōu)化修飾條件合成其他產(chǎn)物，評價和比較修飾產(chǎn)物的金屬離子螯合能力。

1 材料與設(shè)備

1.1 主要材料

脫脂大豆蛋白粉，哈爾濱高科技蛋白有限公司;Alcalase 2.4L FG，諾維信生物技術(shù)有限公司，酶活力110 kU/g;3-(2-吡啶基)-5，6-雙(4-苯磺酸)-1，2，4-三嗪(Ferrozine)，Sigma公司。其它所用試劑均為分析純試劑，所用水為超純水或蒸餾水。

1.2 主要設(shè)備

UV-2401PC型紫外可見分光光度計;AL204型分析天平;G1-21M型冷凍離心機;LGJ-1型空冷凍干燥機;HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱;DELTA 320型精密pH計;H-1型微型漩渦混合器;YH-4BS型遠紅外恒溫干燥箱;DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋。

2 方法

2.1 大豆分離蛋白的制備

參照文獻［6］并略作修改。采用凱氏定氮法確定其蛋白質(zhì)含量約為92.1%。

2.2 大豆蛋白水解物的制備

配置濃度為8%(m/V)的大豆分離蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.0，加入堿性蛋白酶(1 kU/g蛋白質(zhì))，55℃恒溫水浴中進行酶解。于不同酶解時間(0.5～7 h)取出樣品20 mL，迅速在95℃沸水浴中加熱15 min，冷卻至室溫后10 000 r/min離心20 min，分離出上清液;測定上清液水解度、亞鐵和鈣離子螯合能力。根據(jù)測定結(jié)果，確定適宜的水解時間，放大實驗，冷凍干燥后保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 醇-水介質(zhì)中大豆蛋白水解物的類蛋白反應(yīng)條件優(yōu)化

采用Alcalase催化類蛋白反應(yīng)，根據(jù)高博等［5］的研究，采用中心組合試驗，固定底物濃度為30%(m/V)，反應(yīng)溫度4 h，以反應(yīng)產(chǎn)物的游離氨基減少量為響應(yīng)值，分別研究酶添加量、乙醇體積分數(shù)、反應(yīng)溫度的影響，采用3因素5水平響應(yīng)面方法分析，其因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析的因素水平編碼表

應(yīng)用上述響應(yīng)面優(yōu)化出來的條件，分別制備反應(yīng)時間為1～8 h的類蛋白反應(yīng)修飾產(chǎn)物，以大豆蛋白水解物和大豆分離蛋白為對照，測定其金屬離子鰲合能力。

2.4 相關(guān)分析

2.4.1 酶活力、蛋白質(zhì)含量、游離氨基含量與蛋白質(zhì)水解度測定

(1)蛋白酶活力測定:采用福林酚法［8］。

(2)蛋白質(zhì)含量測定:采用凱氏定氮法［9］。

(3)游離氨基含量水解度(DH)測定:采用鄰苯二甲醛法［10-11］。計算公式［12］為:

式中:0.35 mmol/g為大豆分離蛋白的游離氨基含量。

2.4.2 亞鐵和鈣離子螯合能力測定

采用Xu等［13］方法測定亞鐵離子螯合能力，稍有改動。取250 μL 1mg/mL的樣品溶液(樣品最終濃度為 100 μg/mL)直接與 150 μL 0.5 mmol/L FeCl2溶液混合(最終濃度為30 μmol/L)，加入一定量超純水，使反應(yīng)體系終體積為1.5 mL?；靹蚝?，放置2 min，再加入 1mL 500 μmol/L 的 Ferrozine水溶液(Ferrozine終濃度為 200 μmol/L)，充分振蕩、混勻?；旌象w系在室溫下靜置10 min，紫外分光光度法562 nm下測吸光值。EDTA溶液(終濃度為10 μmol/L)為對照樣。亞鐵離子的螯合率:

式中:AT，樣品吸光度;AC，空白吸光度［X μL 0.5 mmol/L FeCl2溶液加入(1 500-X)μL超純水］。

采用楊云裳等［14］方法定鈣離子螯合能力，略有改動。

繪制鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確吸取0.5%鉻黑T-聚乙二醇乙醇溶液0.1 mL于25 mL比色管中，取2 mL pH 10氯化銨-氨水緩沖溶液加入比色管中，再加入1 mL(0、40、80、120、160 和200 μg/mL)鈣離子的水溶液，室溫放置20 min，然后在510 nm波長處測定吸光值。

在25 mL的圓底燒瓶中加入0.2 mol/L CaCl2-乙醇溶液2 mL，緩慢滴加溶有1%修飾產(chǎn)物的50%的乙醇溶液10 mL，在室溫下，攪拌反應(yīng)1 h，離心分離，收集上清液。將上清液稀釋10倍，按照上述方法測定剩余鈣的吸光度值。樣品對鈣離子的螯合率:

式中:A，加入的鈣離子濃度(mg/mL);B，剩余的鈣離子濃度(mg/mL)。

2.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

采用SPASS17.0軟件和Design Expert7.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 大豆蛋白水解物的制備

堿性蛋白酶對大豆分離蛋白進行水解時，水解產(chǎn)物因水解時間不同而肽分子組成不同，其金屬離子螯合能力不同。EDTA以及不同水解時間的大豆分離蛋白水解物對亞鐵和鈣離子螯合能力如表2。

表2 水解時間對大豆分離蛋白水解物的水解度以及亞鐵和鈣離子鰲合能力的影響

數(shù)據(jù)顯示，大豆蛋白水解物對亞鐵離子和鈣離子的鰲合能力隨水解度的增大而增大;但是，水解4 h后水解產(chǎn)物的水解度變化不顯著，且鰲合能力提升的幅度不大。產(chǎn)生這種情況的結(jié)果可能是，由于水解物中的肽段的長度及結(jié)構(gòu)不同而影響其對離子的螯合作用［15］。有研究發(fā)現(xiàn)，花生蛋白水解物水解度同，其金屬離子螯合能力不同［1］。因此，制備水解反應(yīng)為4 h、水解度為14%的大豆蛋白水解物，作為類蛋白反應(yīng)的底物。

3.2 類蛋白反應(yīng)條件的優(yōu)化

類蛋白反應(yīng)優(yōu)化的實驗結(jié)果見響應(yīng)面曲面圖(圖1)。通過軟件分析，表明影響響應(yīng)值的各因素主次順序為乙醇體積分數(shù)、反應(yīng)溫度、酶添加量。反應(yīng)溫度和乙醇體積分數(shù)二者之間相互作用對游離氨基含量變化影響較大(P＜0.05)。反應(yīng)溫度和酶添加量二者之間的相互作用較小(P＞0.05)。乙醇體積分數(shù)和酶添加量二者之間相互作用比較小(P＞0.05)。乙醇體積分數(shù)對類蛋白反應(yīng)的影響最顯著(P＜0.01)，可能是由于乙醇的加入降低了體系的水活度而導(dǎo)致的。水分活度影響類蛋白反應(yīng)產(chǎn)物的形成，低水分活度能抑制酶的水解，使反應(yīng)向合成方向進行［16］。反應(yīng)溫度對類蛋白反應(yīng)也有影響，游離氨基減少量隨反應(yīng)溫度的增加而減少，表明反應(yīng)溫度增加使得反應(yīng)向水解的方向進行。有研究表明，類蛋白反應(yīng)是放熱反應(yīng)，故較低溫有利于反應(yīng)的進行［17］。

圖1 大豆蛋白水解物的乙醇-水介質(zhì)中類蛋白反應(yīng)試驗結(jié)果

綜合分析得到大豆蛋白水解物類蛋白反應(yīng)修飾的適宜條件為:乙醇體積分數(shù)為56.8%，反應(yīng)溫度為33.1℃;酶添加量為5.26 kU/g蛋白質(zhì)。反應(yīng)產(chǎn)物的游離氨基減少量理論值為129.4 μmol/g蛋白質(zhì)，實際值為129.3 μmol/g蛋白質(zhì)(平行3次)，與理論值差異不大，得到的條件參數(shù)可靠。

3.3 修飾產(chǎn)物的金屬離子螯合能力

利用前述條件，在反應(yīng)時間分別為1-8 h下制備出反應(yīng)程度不同的8個修飾產(chǎn)物(MPP 1-8)。另外，用甲醇替代乙醇，分別制備反應(yīng)程度不同的8個修飾產(chǎn)物(MPP 9-16)。這16個產(chǎn)物的游離氨基減少量、以及對亞鐵和鈣離子螯合能力見表3。

表3 類蛋白反應(yīng)修飾產(chǎn)物的亞鐵和鈣離子鰲合能力

通過表2、表3中的數(shù)據(jù)比較可知，MPP 1-16對亞鐵離子螯合能力比大豆蛋白水解物的更強，對鈣離子鰲合能力也顯示出類似規(guī)律。MPP 1-16的亞鐵離子與鈣離子螯合能力，隨類蛋白反應(yīng)程度的增大(反應(yīng)時間1～4 h)先呈現(xiàn)增強趨勢，隨著反應(yīng)程度的繼續(xù)增大(反應(yīng)時間5～8 h)，螯合能力則呈現(xiàn)下降趨勢。類蛋白反應(yīng)是一種轉(zhuǎn)肽和聚合作用，在反應(yīng)過程中會形成新的肽段，從而使得MPP 1-16的亞鐵離子與鈣離子螯合能力有一定程度的提高;隨著反應(yīng)程度的提高，將原有的活性位點破壞，反而導(dǎo)致螯合能力下降。所以，MPP 1-16對2個離子螯合能力與反應(yīng)程度有關(guān)。

由表3數(shù)據(jù)還可以看出，MPP 1-8(乙醇-水介質(zhì)中的修飾產(chǎn)物)的亞鐵離子與鈣離子螯合能力，低于MPP 9-16(甲醇-水介質(zhì)中的修飾產(chǎn)物)?？赡苁怯捎谒只疃饶軓娏矣绊懨傅幕盍σ约胺磻?yīng)程度;水分活度越大，酶的活力越大，反應(yīng)程度也隨之越大［18］。相同醇體積分數(shù)時，乙醇-水介質(zhì)的水分活度大于甲醇-水介質(zhì)。因此，MPP 1-8反應(yīng)程度大于MPP 9-16，相應(yīng)的，對2個離子的螯合能力低一些。

蛋白質(zhì)對鈣離子和亞鐵離子的螯合能力越強，越能夠提高元素的生物利用率，越有利于機體對礦物質(zhì)元素的吸收利用率［19］。過渡金屬如亞鐵離子和銅離子能夠促進脂肪氧化;蛋白質(zhì)等對它們的螯合作用，有助于降低氧化速度，減緩食品的腐敗［4］。蛋白質(zhì)水解物的類蛋白反應(yīng)修飾，可以提高修飾產(chǎn)物對亞鐵和鈣離子的螯合能力，顯示出了此反應(yīng)對于改善蛋白質(zhì)水解物的功能性質(zhì)。

4 結(jié)論

(1)堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白，在55℃、底物濃度8%(w/v)、pH值8.0、酶添加量5.26 kU/g蛋白質(zhì)的條件下水解4 h，可以得到水解度為14.1%大豆蛋白水解物，它對亞鐵離子與鈣離子螯合能力分別為39.8%和62.1%，高于大豆分離蛋白。

(2)通過堿性酶催化的類蛋白反應(yīng)，底物濃度為30%、反應(yīng)時間為4 h下，響應(yīng)面優(yōu)化出乙醇-水介質(zhì)中的適宜反應(yīng)條件為:酶添加量5.26 kU/g蛋白質(zhì)、乙醇體積分數(shù)56.8%、溫度33.1℃;對反應(yīng)影響的主次順序為乙醇體積分數(shù)、反應(yīng)溫度、酶添加量。

(3)應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化出的適宜條件，在乙醇-水、甲醇-水體系中，反應(yīng)時間分別為1～8 h，制備出的16個修飾產(chǎn)物，其對亞鐵和鈣離子的螯合能力高于大豆蛋白水解物，表明類蛋白反應(yīng)修飾可以提高產(chǎn)物的金屬離子螯合能力。

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