鄧遵，彭劍峰，宋永會(huì)* ，袁林江

1.西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，陜西 西安 710055

2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院城市水環(huán)境科技創(chuàng)新基地，北京 100012

目前厭氧反應(yīng)器酸化問(wèn)題日益嚴(yán)重，國(guó)內(nèi)外有很多關(guān)于厭氧折流板反應(yīng)器(Anaerobic Baffled Reactor，ABR)酸化特征及相應(yīng)的恢復(fù)方法的研究報(bào)道［1-3］。這些研究主要集中在由高負(fù)荷運(yùn)行引起的pH降低以及反應(yīng)器酸化，恢復(fù)方法的研究局限于降低負(fù)荷、提高堿度等物理化學(xué)恢復(fù)方法。對(duì)于其他問(wèn)題引起的酸化(如抑制劑對(duì)微生物的抑制作用引起的酸化等)及其對(duì)ABR反應(yīng)器的運(yùn)行效果和微生物群落影響的研究較為缺乏，因而難以為酸化恢復(fù)方法的拓展提供有效支撐。

表面活性劑既是民用洗滌劑的重要原料，又是眾多工業(yè)部門(mén)所必需的助劑，所以有“工業(yè)味精”的美稱(chēng)，并開(kāi)始向獨(dú)立的精細(xì)化工產(chǎn)品的方向發(fā)展。隨著世界人口數(shù)量的增加，對(duì)日化產(chǎn)品的需求也同步增長(zhǎng)［4］。2- 溴乙烷磺酸鈉(BrCH2CH2SO3Na，BES)是合成新型表面活性劑不可缺少的原料之一［5-8］，如以BES、乙二胺、月桂酸等為主要原料合成的陰離子型雙子表面活性劑乙撐-雙(N-乙磺酸-十二酰胺)鈉鹽，以及以BES為親水基物料和烷基咪唑啉合成的磺基咪唑啉甜菜堿表面活性劑等。

同時(shí)，2-溴乙烷磺酸鈉是產(chǎn)甲烷菌特有的輔酶M(2-巰基乙烷磺酸)的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，可選擇性地抑制幾乎所有產(chǎn)甲烷菌的產(chǎn)甲烷活性［9］，當(dāng)產(chǎn)甲烷菌受到抑制時(shí)，產(chǎn)酸菌和產(chǎn)甲烷菌之間的代謝平衡將會(huì)遭到破壞，乙酸、甲酸、甲醇等物質(zhì)不能通過(guò)產(chǎn)甲烷菌的作用而降解，造成乙酸等揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)的積累，使厭氧消化過(guò)程滯留在產(chǎn)酸階段，從而導(dǎo)致反應(yīng)器的酸化。筆者分析了由BES引起的厭氧酸化過(guò)程中反應(yīng)器內(nèi)CODCr去除率、pH以及VFA的變化，并著重研究了BES對(duì)ABR各隔室污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)及其演替特征的影響，以期為采用新型生物技術(shù)解決酸化問(wèn)題提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 裝置與方法

試驗(yàn)裝置為三隔室ABR厭氧反應(yīng)器(圖1)，反應(yīng)器總體積為9 L，設(shè)計(jì)水力停留時(shí)間為24 h，溫度維持在(35±1)℃。試驗(yàn)采用模擬廢水(CODCr∶N∶P=350∶5∶1)，其中進(jìn)水 CODCr為 2000 mg/L 左右。接種污泥取自閑置反應(yīng)器中的厭氧顆粒污泥，接種量為3 L。BES投加在進(jìn)水箱中，投加量從0 mmol/L逐漸提高到0.27 mmol/L。

圖1 ABR處理工藝流程Fig.1 Schematic diagram of the anaerobic baffled reactor

1.2 分析方法

1.2.1 常規(guī)指標(biāo)分析方法

CODCr采用重鉻酸鉀法測(cè)定;pH采用PH S-25型數(shù)顯pH計(jì)測(cè)定;VFA采用氣相色譜法測(cè)定。

1.2.2 熒光原位雜交技術(shù)(FISH)

污泥樣品用4%多聚甲醛于4℃恒溫固定過(guò)夜，再利用PBS和乙醇洗滌固定液于-20℃保存?zhèn)溆?。利用超聲打散樣品，?jīng)預(yù)處理后，于46℃雜交2 h，DAPI染色，熒光抗淬滅封片劑封片，在Olympus BX51熒光顯微鏡下觀察、拍照，每種微生物拍5～8組照片，通過(guò)Image-Pro-Plus軟件對(duì)照片進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，最后取平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差為±0.1，F(xiàn)ISH試驗(yàn)中采用的探針［10-13］如表1所示。

1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR－DGGE)

采用Qiagen公司生產(chǎn)的離心式DNA快速提取試劑盒(Qiagen，美國(guó))提取細(xì)菌的總DNA，提取到的總DNA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。再將提取到的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用套式PCR技術(shù)，所用引物如表2所示。首先采用細(xì)菌通用的27F和1378R引物對(duì)總細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增。第二輪PCR以第一輪PCR的產(chǎn)物作為模板，使用357F-GC和518R引物對(duì)總細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

表1 試驗(yàn)所選用的探針類(lèi)型Table 1 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes used in this study

表2 PCR擴(kuò)增中使用的引物Table 2 List of the primers used in PCR amplification

使用D-Code系統(tǒng)(Biorad，美國(guó))對(duì)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分離。DGGE電泳結(jié)果采用Genfinder(Invitrogen，美國(guó))進(jìn)行染色，并利用凝膠成像系統(tǒng)(Biorad GelDoc XR，美國(guó))對(duì)染色后的DGGE結(jié)果進(jìn)行觀察、拍照。將含目的DNA條帶的凝膠割下，放入200μL離心管中搗碎，再加入20μL超純水(ddH2O)，在4℃過(guò)夜溶解。取上清液進(jìn)行PCR，引物采用357F和518R，將PCR產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序中心進(jìn)行 DNA片段序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與NCBI基因文庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)的已知序列進(jìn)行對(duì)比。

1.2.4 圖譜解析方法

各樣品間的相似度指數(shù)可用Dice指數(shù)(CS)表示［14］，其計(jì)算公式:

式中，j為2個(gè)樣品間共有條帶數(shù);a、b分別為2個(gè)樣品各自條帶數(shù)。

采用Shannonce-Wiener多樣性指數(shù)(H')表征微生物種群多樣性［15］，其計(jì)算公式:

式中，pi=ni/N;ni為第i個(gè)條帶的強(qiáng)度;N為所有條帶強(qiáng)度之和。

采用種群豐富度指數(shù)(R)表征樣品的微生物豐富度［16］，其計(jì)算公式:

采用優(yōu)勢(shì)度指數(shù)(D)表征樣品中優(yōu)勢(shì)種群的優(yōu)勢(shì)程度，其計(jì)算公式:

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)CODCr、pH及VFA的影響

圖2和圖3為BES對(duì)ABR反應(yīng)器中CODCr及pH的影響。由圖2和圖3可知，隨著B(niǎo)ES濃度的增加，反應(yīng)器內(nèi) CODCr去除率及 pH急劇下降;當(dāng)BES濃度為0.13 mmol/L時(shí)，CODCr去除率降到20%以下，出水pH降到6.0以下;當(dāng)BES濃度增至0.2和0.27 mmol/L時(shí)，其去除率降到10%以下，出水pH降到5.5以下，ABR反應(yīng)器出現(xiàn)了酸化。

VFA是污染物降解的中間產(chǎn)物，也是評(píng)估反應(yīng)器正常運(yùn)行與否的重要指標(biāo)。BES對(duì)ABR反應(yīng)器中VFA濃度的影響如圖4所示。正常運(yùn)行時(shí)，VFA濃度隨著隔室的增加而減少，出水中只含有少量的乙酸和丙酸，濃度不超過(guò)40μmol/L。而廢水中投加BES后，反應(yīng)器內(nèi)VFA濃度不僅不隨著隔室的增加而減少，反而隨著隔室的增加而增加，出水VFA濃度達(dá)到15.3 mmol/L左右;且VFA的種類(lèi)有所增加，除了乙酸、丙酸之外，還有丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸、異己酸和庚酸，其中丁酸、戊酸、己酸等占36%左右。

綜合考慮CODCr去除率、pH及VFA濃度的變化可知，投加BES后，CODCr去除率急劇下降到10%以下，出水pH降到5.5以下，出水VFA濃度達(dá)到15.3 mmol/L左右，ABR反應(yīng)器形成了酸化環(huán)境。這說(shuō)明BES能抑制產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)甲烷活性［9］，導(dǎo)致VFA等中間產(chǎn)物無(wú)法轉(zhuǎn)化為CH4等最終產(chǎn)物，造成VFA嚴(yán)重積累，從而導(dǎo)致CODCr去除率下降，反應(yīng)器內(nèi)的pH降低，VFA濃度增大及種類(lèi)增多，最終導(dǎo)致ABR反應(yīng)器酸化。

2.2 對(duì)微生物豐富度的影響

取投加BES運(yùn)行穩(wěn)定后污泥樣品，利用FISH技術(shù)來(lái)表征BES對(duì)ABR反應(yīng)器內(nèi)真細(xì)菌、古細(xì)菌及典型微生物相對(duì)豐度的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，投加BES之后，真細(xì)菌的相對(duì)豐度有所增加，平均增加了40%，真細(xì)菌里的典型微生物種群產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌和耗氫產(chǎn)乙酸菌的相對(duì)豐度也有所增加，其中產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌增加了9%，耗氫產(chǎn)乙酸菌增加了7%。而古細(xì)菌的相對(duì)豐度下降了30%，厭氧消化過(guò)程中最關(guān)鍵的產(chǎn)甲烷菌的相對(duì)豐度平均下降了25%左右。

圖5 BES對(duì)ABR反應(yīng)器內(nèi)各種微生物相對(duì)豐度的影響Fig.5 Effect of2-bromoethane sulfonate on relative abundance of microorganisms in ABR reactor

由圖5可知，BES對(duì)產(chǎn)甲烷菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，由于BES抑制了產(chǎn)甲烷菌的活性，使產(chǎn)甲烷菌不能消耗VFA，進(jìn)而造成了VFA的積累。VFA的積累會(huì)進(jìn)一步抑制產(chǎn)甲烷菌的活性，造成惡性循環(huán)，因此產(chǎn)甲烷菌的相對(duì)豐度大大降低。產(chǎn)甲烷菌是ABR反應(yīng)器中最主要的古細(xì)菌，其豐富度的降低造成古細(xì)菌的相對(duì)豐度大幅減少。

VFA的積累增加了產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌所能利用的營(yíng)養(yǎng)底物，促進(jìn)了產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)釋放出更多的氫氣，氫氣的增加又會(huì)促進(jìn)耗氫產(chǎn)乙酸菌的作用，刺激耗氫產(chǎn)乙酸菌的生長(zhǎng)，因此產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌和耗氫產(chǎn)乙酸的相對(duì)豐度都有很大程度的提高。

2.3 對(duì)真細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 DGGE指紋圖譜、相似性與多樣性分析

對(duì)ABR反應(yīng)器正常運(yùn)行及投加BES運(yùn)行穩(wěn)定后的各隔室污泥樣品進(jìn)行DNA提取，PCR擴(kuò)增及DGGE分析，可得到真細(xì)菌的DGGE指紋圖譜，如圖6所示。

圖6 投加BES前后ABR反應(yīng)器內(nèi)各隔室厭氧污泥的DGGE指紋圖譜Fig.6 DGGE fingerprints patterns of anaerobic sludge in the compartments of ABR reactor

由圖6可見(jiàn)，六個(gè)樣品的DGGE條帶數(shù)量有明顯的差異，投加BES之后，DGGE條帶數(shù)有所減少;并且不同污泥樣品中的優(yōu)勢(shì)菌種結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的改變。污泥樣品的種群相似度(表3)均在75%以下，第一隔室的相似度為67.8%，第二隔室的相似度為74.2%，第三隔室的相似度僅為59.4%。在樣品a中，Band1和Band2是正常運(yùn)行時(shí)第一隔室的優(yōu)勢(shì)菌帶，而在樣品d中，除了Band1和Band2繼續(xù)存在以外，增加了五條很亮的條帶。對(duì)比b和e兩個(gè)樣品，樣品e中有五條很亮的條帶，而在樣品b中有三種菌帶雖然存在，但是亮度有所減弱，并且優(yōu)勢(shì)菌帶不明顯。樣品c中的優(yōu)勢(shì)菌帶為 Band8和Band10，在樣品f中，Band8依然存在，但是亮度有所減弱，同時(shí)增加了四種優(yōu)勢(shì)菌帶。

表3 污泥DGGE指紋圖譜的相似度矩陣Table 3 Dice index comparing the similarity of DGGE fingerprints %

微生物種群多樣性指數(shù)(H')、豐富度指數(shù)(R)和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)(D)分別是從不同角度反映微生物種群類(lèi)型、種群結(jié)構(gòu)的差異以及種群演替的變化。各指數(shù)的計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，投加BES之后，ABR反應(yīng)器內(nèi)各隔室的污泥樣品的DGGE指紋圖譜中條帶數(shù)即微生物種數(shù)均有所減少，種群的多樣性指數(shù)和豐富度也呈現(xiàn)出相似的變化特征。而投加BES之后，ABR反應(yīng)器內(nèi)的優(yōu)勢(shì)微生物的優(yōu)勢(shì)度明顯增大。

表4 投加BES前后ABR反應(yīng)器內(nèi)各隔室污泥中微生物種群多樣性指數(shù)Table 4 Microbial community diversity index of anaerobic sludge in the compartments of ABR reactor

通過(guò)圖6，表3和表4的比較可知，投加BES后，微生物種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。首先，有一些對(duì)環(huán)境敏感的細(xì)菌死亡并消失，使得反應(yīng)器內(nèi)的真細(xì)菌種類(lèi)有所減少，導(dǎo)致微生物種群多樣性和豐富度相應(yīng)減少，說(shuō)明BES對(duì)ABR反應(yīng)器內(nèi)某些種類(lèi)的細(xì)菌有很強(qiáng)的抑制作用。其次，ABR反應(yīng)器內(nèi)的優(yōu)勢(shì)微生物種類(lèi)增多，并且優(yōu)勢(shì)度明顯。這可能是因?yàn)槲⑸锓N群的自主馴化作用，投加BES后，經(jīng)過(guò)一個(gè)月的馴化培養(yǎng)，誘發(fā)出適應(yīng)BES的微生物，同時(shí)淘汰劣勢(shì)微生物，因此優(yōu)勢(shì)微生物的數(shù)量增多，優(yōu)勢(shì)度提高。

2.3.2 部分優(yōu)勢(shì)菌種的鑒定

將目標(biāo)微生物進(jìn)行DNA片段序列測(cè)定，其測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知菌種的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如表5所示。由表5可知，投加 BES后，ABR反應(yīng)器各隔室的優(yōu)勢(shì)微生物均發(fā)生了很大改變。以第一隔室為例，ABR正常運(yùn)行時(shí)的優(yōu)勢(shì)微生物與Uncultured bacterium clone cs78相似度為99%，屬于Firmicutes(厚壁菌)，與乳酸鹽和硫酸鹽的去除有關(guān)［17］。而投加BES后，優(yōu)勢(shì)微生物變?yōu)榕c Uncultured bacterium clone 23-1、Uncultured rumen bacterium clone RDX_194-Control_0_hr、Uncultured bacterium SHA-116及Uncultured bacterium clone:OS-100相似。其中 Uncultured bacterium clone 23-1屬于 Bacteroides(擬桿菌)，與乙醇發(fā)酵有關(guān)［18］;Uncultured rumen bacterium clone RDX_194 屬于 Bacterium，與 1，3，5-trinitro-1，3，5-triazacyclohexane的轉(zhuǎn)化有關(guān);Uncultured bacterium SHA-116與氯的去除有關(guān)，屬于Spirochaetes(螺旋體菌)［19］;而 Uncultured bacterium clone:OS-100 是δ-proteobacteria(δ-變形菌)，與乙酸鹽或甲醇的同化有關(guān)［20］。

表5 部分優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的克隆測(cè)序結(jié)果Table 5 Phylogenetics of dominant bacteria

通過(guò)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的測(cè)序結(jié)果可知，投加BES后，ABR反應(yīng)器各隔室內(nèi)的優(yōu)勢(shì)微生物種群發(fā)生了很大改變，第一隔室由厚壁菌門(mén)變?yōu)閿M桿菌門(mén)、螺旋菌門(mén)及δ-變形菌門(mén);第二隔室的優(yōu)勢(shì)微生物由擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)變?yōu)榈貤U菌科微生物、δ-變形菌門(mén)及厚壁菌門(mén);第三隔室由桿菌屬、厚壁菌門(mén)變?yōu)楹癖诰T(mén)及螺旋菌門(mén)。

3 結(jié)論

(1)隨著進(jìn)水中BES投加量從0 mmol/L增加到0.27 mmol/L，ABR反應(yīng)器的 CODCr去除率從95%降到10%，且一直維持在10%以下，出水pH從6.0～7.0降到5.5以下。說(shuō)明BES的投加對(duì)厭氧消化過(guò)程有很大的影響，容易導(dǎo)致反應(yīng)器酸化。

(2)BES的投加，造成反應(yīng)器內(nèi)VFA明顯積累，VFA濃度隨著隔室的增加而增加，出水VFA濃度達(dá)到15.3 mmol/L左右;同時(shí)出水VFA組成由BES投加前的以乙酸、丙酸為主，變?yōu)橐宜?、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸、異己酸和庚酸，其中丁酸、戊酸、己酸等占總VFA的36%。

(3)BES會(huì)抑制產(chǎn)甲烷菌的活性，從而使產(chǎn)甲烷菌的相對(duì)豐度平均降低25%左右。同時(shí)，BES使產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌及耗氫產(chǎn)乙酸菌的相對(duì)豐度分別增加了9%和7%。

(4)投加BES后，ABR反應(yīng)器各隔室的微生物種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，其最低相似度僅為59.4%。BES的投加，使ABR中的微生物種類(lèi)、種群多樣性及豐富度均有所降低，微生物種類(lèi)由二十幾種降到十幾種，種群多樣性指數(shù)由3.27降到2.75;優(yōu)勢(shì)微生物種群由厚壁菌門(mén)、桿菌屬變?yōu)閿M桿菌門(mén)、螺旋菌門(mén)及δ-變形菌門(mén)。

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