顧小軍，沈玲，黃英

(東南大學附屬第二醫(yī)院內科，江蘇南京 210003)

狂犬病是由狂犬病病毒引起的人畜共患傳染病，病死率100%，全世界每年有6萬人死于該?。?］，近幾年每年約1 200～1 500萬人接受狂犬病病毒暴露后接種［2］。目前降低暴露后病人發(fā)病最關鍵和最有效的方法就是實施暴露后狂犬病疫苗免疫。在緊急暴露患者，特別是潛伏期較短的患者，如何使機體盡快產生抗狂犬病病毒的保護性中和抗體，或者在抗體產生前機體具有一定的抵抗力是直接關系到免疫成敗的關鍵［3］。有研究［4-5］顯示胸腺肽可加強狂犬病疫苗的接種效果，我們使用單劑量胸腺肽聯(lián)合狂犬病疫苗進行接種，對其增強狂犬病疫苗的療效進行了觀察和研究。

1 對象和方法

1.1 研究對象及分組

狂犬病暴露后的人群中Ⅱ級咬傷者100例，年齡18～59歲，身體健康，無不良嗜好。分成疫苗組50例，單獨給予狂犬病疫苗 2.5 U，按 0、3、7、14、28 接種;胸腺肽組50例，在疫苗組基礎上首針加用單劑量胸腺肽50 mg肌肉注射。

1.2 試劑

胸腺肽50 mg·支-1，長春普華制藥生產;狂犬病疫苗2.5 U·支-1，賽諾菲巴斯德公司生產。

1.3 實驗方法

在注射前(D0)、注射后7 d(D7)、注射6個月、注射12個月測定外周血淋巴細胞總數(shù)、γ-干擾素(IFN-γ)、白細胞介素-2(IL-2)水平，在注射后7 d、注射6個月、注射12個月測定中和抗體水平。外周血淋巴細胞總數(shù)采用全血細胞計數(shù)儀計數(shù)，由本院檢驗中心完成。IL-2和IFN-γ含量測定采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定，試劑購自上海森雄科技實業(yè)有限公司，嚴格按照試劑盒說明書操作。IL-2最低檢測值為＞16 pg·ml-1，IFN-γ 最低檢測值為 ＞8 pg·ml-1。中和抗體測定采用快速熒光灶抑制試驗(RFFIT)，按參考文獻［6］使用的方法檢測，具體操作由武漢生物制品研究所進行。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 實驗前后兩組外周血淋巴細胞總數(shù)比較

兩組組內及組間各時間點外周血淋巴細胞總數(shù)無差異(P＞0.05)，見表1。

表1 各組外周血淋巴細胞測定結果(±s)×109L－1

表1 各組外周血淋巴細胞測定結果(±s)×109L－1

組 別 不同時間點淋巴細胞總數(shù)D0 D7 M6 M12疫苗組2.04±0.57 1.95±0.49 2.04±0.39 2.01±0.42胸腺肽組1.97±0.65 1.93±0.38 1.98±0.36 1.87±0.31

2.2 兩組不同時間點血清IL-2水平的比較

疫苗組在注射后6個月IL-2水平升高，與注射前、注射后7 d相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);注射后12個月IL-2水平恢復至注射前水平，與注射后6個月相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。胸腺肽組IL-2水平在注射后7 d開始升高(P＜0.01)，7 d與6個月差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);注射后12個月下降至注射前水平，與注射后7 d、6個月比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。兩組間IL-2的水平在注射前、注射后6個月、12個月差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，注射后7 d胸腺肽組IL-2水平與疫苗組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組不同時間點 IL-2水平的比較(±s，n=50) pg·ml－1

表2 兩組不同時間點 IL-2水平的比較(±s，n=50) pg·ml－1

與同組M6比較，a P＜0.01;與同組D7及M6比較，b P＜0.01;與疫苗組同時點比較，c P＜0.01

組 別不同時間點IL-2的水平D0 D7 M6 M12疫苗組 62.00±13.07a 59.83±8.35a 70.76±12.44 60.26±13.10a胸腺肽組 59.79±15.50b 65.53±14.00c 70.27±11.90 58.70±17.03b

2.3 兩組不同時間點IFN-γ水平的比較

疫苗組IFN-γ水平在注射后7 d明顯升高，與注射前比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，注射后6個月與注射后7 d相比，IFN-γ水平有所下降(P＜0.05)，注射后12個月降至注射前水平。胸腺肽組注射后7 d及6個月，IFN-γ水平明顯升高(P＜0.01)，注射后12個月恢復至注射前水平。胸腺肽組IFN-γ水平在注射后7 d明顯高于疫苗組(P＜0.05)，其它時間點兩組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表3。

表3 兩組不同時間點IFN-γ的比較(±s，n=50)pg·ml－1

表3 兩組不同時間點IFN-γ的比較(±s，n=50)pg·ml－1

與同組D7比較，a P＜0.01，b P＜0.05;與同組M6比較，c P＜0.05;與同組D7、M6比較，d P＜0.01;與疫苗組同時點比較，e P＜0.05

組 別不同時間點IFN-γ水平D0 D7 M6 M12疫苗組 15.35±3.03ac 17.92±2.66c 16.67±3.50b 14.72±2.91ac胸腺肽組 15.49±1.85d 19.05±2.73e 16.57±2.24 14.90±1.98d

2.4 兩組不同時間點抗狂犬中和抗體水平的比較

兩組組內各時間點比較，中和抗體水平差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);胸腺肽組在注射7 d時中和抗體水平明顯高于疫苗組(P＜0.01)，在注射后6個月和12個月與疫苗組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表4。

表4 兩組不同時間點抗狂犬病中和抗體水平的比較(±s，n=50) IU·ml－1

表4 兩組不同時間點抗狂犬病中和抗體水平的比較(±s，n=50) IU·ml－1

同組不同時點相比，a P＜0.01;與疫苗組同時點相比，b P＜0.01

組 別 不同時間點中和抗體水平D7 M6 M12疫苗組 0.46±0.11a 4.07±1.13a 0.68±0.38a胸腺肽組 0.51±0.13ab 4.55±1.37a 0.72±0.21a

在注射后7 d疫苗組中和抗體水平＞0.5 IU·ml-1病例數(shù)為3例，胸腺肽組為10例，胸腺肽組抗體產生率高于疫苗組(χ2=4.33，P＜0.05)。在注射后6個月兩組都能產生有效抗體，陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，12個月時抗體都有下降，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.5 IL-2、γ-IFN和中和抗體的動態(tài)變化

兩組體內IL-2水平在注射后7 d開始上升，到6個月時進一步上升，到12個月時基本恢復正常，見圖1。

圖1 兩組血清IL-2水平的動態(tài)變化

兩組體內IFN-γ在注射后7 d上升明顯，到6個月時仍高于接種前，到12個月時恢復正常，見圖2。

圖2 兩組血清IFN-γ水平的動態(tài)變化

兩組中和抗體在接種后7 d即有上升，6個月時最高，12個月時下降明顯，但高于7 d時的水平，見圖3。

圖3 兩組血清中抗狂犬中和抗體水平的動態(tài)變化

2.6 中和抗體和其他指標的相關性

疫苗組中和抗體與IL-2水平的 Pearson值為0.395(P＜0.01)，與淋巴細胞總數(shù)的 Pearson值為0.146(P＞0.05)，與 IFN-γ的 Pearson值為0(P＞0.05)。

胸腺肽組中和抗體與IL-2水平的Pearson值為0.235(P＜0.01)，與淋巴細胞總數(shù)的Pearson值為0.022(P＞0.05)，與 IFN-γ的 Pearson值為 0.011(P ＞0.05)。

2.7 疫苗和胸腺肽的安全性評估

所有病例皆無明顯的不良反應，注射部位紅腫23例(疫苗組11例，胸腺肽組12例)，低熱15例(疫苗組7例，胸腺肽組8例)，乏力12例(疫苗組7例，胸腺肽組5例)，無其他嚴重不良反應，兩組比較不良反應發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3 討 論

研究顯示，狂犬病病毒暴露前免疫接種有利于狂犬病的預防［7］。對于狂犬病緊急暴露后的處理措施，目前降低暴露后人群發(fā)病最關鍵和最有效的方法就是實施暴露后狂犬疫苗免疫?；颊咴诰o急狂犬病暴露時，尤其是明確的狂犬咬傷，要嚴格遵照動物咬傷的處理順序，局部傷口處理、疫苗接種和抗狂犬血清/免疫球蛋白缺一不可，Ⅱ級傷口使用狂犬疫苗，Ⅲ級傷口使用狂犬疫苗加抗狂犬免疫球蛋白。但盡管如此，在全國各地仍有嚴格按照預防接種程序處理后仍然發(fā)病的病例發(fā)生［8］，其中免疫功能低下［9］、有慢性消耗性疾病等都會影響抗體的產生［10］。在緊急暴露人群，特別是潛伏期較短者，如何使機體盡快產生抗狂犬病病毒的保護性中和抗體，或者在抗體產生前機體具有一定的抵抗力是直接關系到免疫成敗的關鍵。

胸腺肽是一種很好的免疫調節(jié)劑，主要增強機體的免疫功能，能連續(xù)誘導T淋巴細胞分化、成熟、發(fā)育，使CD4+T細胞數(shù)目增加;增強IL-2受體的表達，增強自然殺傷細胞的能力，調節(jié)內分泌。不同劑量的胸腺肽對機體免疫功能的調節(jié)也不同，較低劑量產生免疫促進作用，較高劑量產生免疫抑制作用［11］。Cardenas等［12-13］研究發(fā)現(xiàn)在小鼠感染狂犬病模型中，胸腺是最易受傷的的淋巴器官，小鼠死亡前胸腺細胞呈現(xiàn)高水平的CD4或CD8表達，胸腺萎縮明顯，淋巴細胞凋亡。免疫低下或胸腺萎縮的人群接種疫苗效果較差［14］。史秀山等［4-5］使用小鼠研究發(fā)現(xiàn)加用單劑量胸腺肽(2 mg·只-1)后抗體效價高且抗體產生時間早，抗體水平高，減少免疫次數(shù);而使用轉移因子則只能增強狂犬病疫苗免疫的效果，不能減少免疫次數(shù)。我們使用單劑量(1 mg·kg-1)胸腺肽聯(lián)合狂犬病疫苗對Ⅱ級咬傷的狂犬病暴露后人群進行預防接種，動態(tài)觀察IL-2、INF-γ水平和中和抗體含量的變化，發(fā)現(xiàn)其能促進注射后7 d中和抗體的產生，但不能延緩抗體的有效保護時間。

IL-2可作用于T細胞、B細胞，調節(jié)B細胞的分化、增殖及功能，在疫苗接種產生相應抗體的過程中起著重要作用［15］，如能夠降低免疫缺陷患者接種疫苗的副反應，提高免疫的效果［16］，使小鼠產生抗體的時間提前，抗體效價高［17］;因此，接種狂犬疫苗后體內IL-2的水平可以用于評價狂犬病疫苗的保護力［18］，犬接種狂犬病疫苗后體內IL-2、IFN-γ水平皆出現(xiàn)明顯上升［19-21］。

在本次研究中，兩組接種疫苗后機體IL-2和IFN-γ水平皆有明顯上升，加用單劑量胸腺肽能增加接種7 d后的抗體含量，加快抗體產生的速度，對于狂犬病暴露者胸腺肽是安全的，可作為一種免疫增強劑用于狂犬病疫苗接種。

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