巴俊，于靖

(同濟大學附屬上海市第十人民醫(yī)院眼科，上海 200072)

脈絡膜新生血管(choroidal neovascularition，CNV)又名視網膜下新生血管，是來自正常脈絡膜組織的增殖血管，可通過Bruch膜破損處進入Bruch膜與視網膜色素上皮層(retinal pigment epithelium，RPE)之間、視網膜神經上皮層與RPE之間、RPE與脈絡膜之間。CNV是許多脈絡膜視網膜疾病，如年齡相關性黃斑變性滲出期、高度近視黃斑變性等發(fā)生發(fā)展中的重要病理機制。為了進一步發(fā)現(xiàn)這些疾病確切的發(fā)病機理，制作接近臨床特征的CNV動物模型是必要的前提?，F(xiàn)對近年來的CNV動物模型的制作進展綜述如下。

1 激光誘導CNV模型

1.1 激光誘導CNV模型的機制

血管生成是正常組織生長和修復的一種生理過程，整個過程受到維持動態(tài)平衡狀態(tài)的血管生成因子和抑制因子的嚴密調控。當平衡遭到破壞，新生血管形成。人類CNV疾病的確切發(fā)病機制尚不明確，但是已確定與一些血管生成因子，如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)［1］、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)［2］、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)等有密切聯(lián)系。脈絡膜毛細血管內皮細胞、周細胞、成纖維細胞等可以釋放這些細胞因子［3-4］。激光誘導CNV模型和人類CNV疾病產生的病理基礎，都基于破壞RPE-Bruch膜-脈絡膜毛細血管復合體，打破血管生成因子和抑制因子的平衡，產生新生血管。新生血管中包含炎癥細胞、血管成分和細胞外基質，CNV的產生均來源于脈絡膜血管。

與人類CNV疾病的發(fā)生機制不同的是，激光是通過對視網膜產生機械損傷、熱效應和光化學等生物效應造成Bruch膜破壞，使視網膜在炎癥修復過程中產生新生血管［5］。人類CNV疾病的發(fā)生包括炎癥反應、血管生成和蛋白酶水解3個階段，它們之間相互作用共同促進CNV的發(fā)生發(fā)展。在視網膜微環(huán)境發(fā)生改變的早期起始階段，RPE和光感受器產生VEGF［6］，趨化巨噬細胞集中至Bruch膜生成血管的部位［7］，產生蛋白水解酶作用破壞Bruch膜，誘發(fā)形成新生血管。

1.2 制作CNV模型的常用激光

目前用于制作CNV模型的激光主要有氪激光、氬激光、二極管激光、Q-開關摻釹釔石榴石(neodymiumdoped yttrium aluminium garnet，Nd:YAG)激光等。激光波長不同，穿透深度亦不同，這對視網膜損傷的作用部位有著重要影響。藍綠氬激光穿透力較弱，主要作用于視網膜內層和RPE層。氪激光主要作用于RPE和脈絡膜內層。1979年Ryan等［8］首次采用激光制作出CNV動物模型，1998年Tobe等［9］將氪激光光凝術應用于制作小鼠CNV模型，此后激光誘導CNV模型被普遍應用于基礎實驗和治療方法的研究中。激光誘導CNV模型的優(yōu)點在于與人類CNV疾病發(fā)生自然過程相似，但不同研究CNV模型成功率不同，與不同實驗采用動物類型、激光種類及對觀察診斷CNV的標準不一有關(表1)。

表1 激光誘導CNV實驗動物模型的相關文獻

1.3 實驗動物

1.3.1 大鼠和小鼠 理想的動物模型應該有以下重要特征:(1)模型制作成功率高;(2)模型持續(xù)時間長且穩(wěn)定;(3)病理學特征與人類CNV疾病病理改變相似;(4)模型制作成本低;(5)模型眼與人眼大小相似，便于模型實驗操作與檢查。激光誘導CNV的模型動物有很多種類，其中鼠類模型的應用最為廣泛。鼠類模型優(yōu)點在于模型制作成功率較高，價格便宜，短時間(一般2～3周)即可觀察到結果。

與人類的視網膜結構相比，剛出生的幼鼠視網膜上即可見未發(fā)育成熟的透明血管，出生后的小鼠分支狀透明血管排列有序［13］，是研究生理性和病理性血管發(fā)生發(fā)展機制較理想的研究對象。大多數(shù)研究參與及影響CNV發(fā)生發(fā)展機制因素的實驗是采用鼠類模型［14-15］。Garcia等［11］用二極管激光光凝大鼠視網膜，并在激光光凝前后分別靜脈注射碘酸鈉破壞視網膜形態(tài)，結果證實RPE層完整性是CNV發(fā)生的決定性因素。Nakai等［16］通過研究激光誘導小鼠基因數(shù)量性狀位點，證實不同個體對細胞因子刺激生成新生血管的易感性不同。

1.3.2 兔 兔眼激光誘導模型在國內應用較為廣泛，優(yōu)點在于兔眼較之鼠眼在大小上更接近人類，易于模型實驗操作與檢查;家兔來源廣泛，費用較低，CNV出現(xiàn)時間早且穩(wěn)定(3～4周)。然而，兔眼視網膜解剖結構與人類不同，視網膜后極部相當于人類黃斑區(qū)，血管供應少，熒光素滲漏特點不典型，但可以用組織學觀察結果作為CNV的判定標準。國內一項研究［12］用倍頻Nd:YAG 532 nm綠激光(功率800 mW，光斑直徑50 μm，曝光時間0.05 s)光凝色素兔視網膜，第3～4周見穩(wěn)定的滲漏光斑，CNV發(fā)生率66.7%，滲漏率51.7%。

1.3.3 猴 猴的視網膜及黃斑結構與人類相似，眼球大小便于操作，具有熒光滲漏的特點，是用于臨床藥物篩選的首選模型［17］。Ryan 等［8］利用氬激光(功率200～950 mW，光斑直徑50～200 μm，曝光時間0.1～0.5 s)光凝猴視網膜成功建立了CNV動物模型，但相比鼠類和家兔，CNV滲漏率較低(僅40%)，且猴來源少，費用高，飼養(yǎng)較困難，模型制作需4周以上，因此應用受限。

2 手術誘導CNV模型

2.1 視網膜下注射VEGF基因的腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)載體

載有VEGF的基因轉導誘導是較為理想的模型。由于炎癥反應可能參與CNV的形成，需用類固醇抑制激光光凝過程中產生的炎癥反應，但用注射針頭經玻璃體腔破壞Bruch膜進行視網膜下AAV注射可避免實驗操作中產生的炎癥反應［18］。其次，人腺病毒血清5型由于其致病性低，無論是在體內或是體外的基因轉導都是理想的載體。近年來，該方法多用于研究通過過表達VEGF誘導的 CNV模型制作。Wang等［18］將2 μl編碼人VEGF-A165腺病毒注射到大鼠視網膜下，CNV發(fā)生率為95%。Julien等［19］在兔眼視網膜下注射5×106IU載有過表達VEGF-A165腺病毒載體誘導CNV模型，CNV發(fā)生率為83%。此外，VEGF-B是VEGF另一種分泌肽，對它在眼內的作用知之甚少。Zhong等［20］將攜帶VEGF-B AAV載體注射到玻璃體腔，發(fā)現(xiàn)VEGF-B過表達可促進病理性視網膜和脈絡膜新生血管，且沒有因對Bruch膜-視網膜血管屏障的破壞造成炎癥。VEGF-B與糖尿病視網膜病變和年齡相關性黃斑變性的發(fā)展密切相關，提示這些疾病的并發(fā)癥不依賴于炎癥反應。

2.2 視網膜下注射基質膠(Matrigel)

Matrigel是一種從 EHS腫瘤(engelbreth holm swarm tumor)中提取出可溶性基底膜基質，其主要成分是層粘連蛋白、Ⅰ型膠原、肝素硫酸化黏蛋白以及一些在EHS腫瘤中自然表達的生長因子，如bFGF、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)。Matrigel在4℃是液體，37℃時呈凝膠狀態(tài)。利用此種特性在視網膜下注射Matrigel，能有效控制生長因子的緩慢釋放，制作持續(xù)時間較長的CNV動物模型。Qiu等［21］在兔眼視網膜下注射Matrigel和VEGF，注射后1周眼底熒光血管造影即可在視網膜局部觀察到滲漏點，滲漏量在2～4周增加，大部分可持續(xù)9周。但Julien等［19］質疑將凝膠狀Matrigel注射到視網膜下，會在視網膜神經上皮層與脈絡膜組織之間形成物理屏障，有悖于滲出性年齡相關性黃斑變性新生血管的發(fā)生機制。

2.3 脂質過氧化氫物

脂質過氧化氫物可以誘導血管生成因子產生CNV。隨著年齡增長，人類眼后極部容易受到氧化損傷產生脂質過氧化氫物。Tamai等［22］將不同劑量(5～200 μg)亞油酸過氧化氫物(linoleic acid hydroperoxide，LHP)注射在兔眼視網膜下，發(fā)現(xiàn)LHP劑量不同會對視網膜會造成不同程度的損害。當注射較小劑量(12.5～25 μg)時，CNV發(fā)生率為46%。而大劑量LHP(≥100 μg)會破壞視網膜和RPE細胞，但是不產生CNV。證實高濃度LHP有顯著毒性，可抑制RPE細胞吞噬LHP，并抑制其增殖產生血管生成因子。Framme 等［23］使用不同濃度 LPH(25 ng/50 ml和100 ng/50 ml)進行兔眼視網膜下注射，結果顯示低濃度組沒有CNV形成，高濃度組CNV發(fā)生率低，僅為27%。組織學發(fā)現(xiàn)視網膜外層破壞顯著，但脈絡膜毛細血管層結構完整。這提示高濃度的LPH對CNV的發(fā)生并沒有優(yōu)勢，與Tamai等［22］研究結果一致。Baba等［24］在大鼠視網膜下注射小劑量(30 ng·ml-1)LHP，獲得85.7%的成功率。同時，研究表明大劑量LHP對神經元、RPE和內皮細胞具有毒性，而小劑量可以促進增殖血管形成。小劑量視網膜下注射LHP在體內無毒性，且能保持視網膜組織完整性，新生血管發(fā)生過程接近人類CNV疾病的發(fā)生發(fā)展，是研究AMD發(fā)生發(fā)展機制，后續(xù)評估光動力學療法或抗VEGF治療的理想模型。

3 小 結

目前，CNV的動物模型建立主要是通過破壞Bruch膜或產生過量生長因子，各有優(yōu)缺點，尚沒有能夠完全模擬人CNV發(fā)生發(fā)展的最為理想的模型。由于不同模型建立的基礎和特點不同，CNV成功率和持續(xù)時間也不同，可將不同制作方法應用于不同方面的研究。

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