張遠旭, 平述煌, 楊世華,*

(1. 昆明理工大學 生命科學與技術學院衰老與腫瘤分子遺傳學實驗室, 云南 昆明650500; 2. 中國科學院和云南省動物模型與人類疾病機理重點實驗室, 中國科學院昆明動物研究所, 云南 昆明 650223)

中緬樹鼩精子形態(tài)特征及冷凍損傷

張遠旭1,2, 平述煌1, 楊世華1,*

(1.昆明理工大學 生命科學與技術學院衰老與腫瘤分子遺傳學實驗室,云南 昆明650500; 2.中國科學院和云南省動物模型與人類疾病機理重點實驗室,中國科學院昆明動物研究所,云南 昆明650223)

樹鼩作為一種新型的、接近靈長類的實驗動物, 在醫(yī)學生物學上的應用受到越來越多的重視。精子的結構特性研究及冷凍后結構的完整性分析是精子生物學的主要內容, 也有助于樹鼩的實驗室快速繁殖。該研究采用人工飼養(yǎng)的中緬樹鼩(Tupaia belangeri chinensis), 結果顯示其睪丸占總體重的(1.05±0.07)%, 總體積為(1.12±0.10) mL。附睪尾及輸精管精子總量估計在2.2×107～8.8×107, 其運動度和頂體完整率分別為(68.8±3.9)%和(90.0±2.1)%。利用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡對樹鼩附睪精子的超微結構進行的觀察和分析顯示精子頭部呈圓形或卵圓形; 頭部長度、寬度平均分別為6.65和5.82 μm; 精子尾部中段、主段、尾段和精子總長度平均分別為13.39、52.35、65.74和73.05 μm; 尾部中段的線粒體螺旋數量為48個, 其軸絲結構為典型的“9+9+2”結構。冷凍解凍后的精子主要表現在頂體與質膜不完整、精子斷裂、尾部扭曲和膨大。上述結果提示樹鼩精子與其他哺乳動物精子的結構特征相似, 但是精子大小和線粒體螺旋數目有明顯的差別, 且超微結構改變仍是冷凍精子運動和受精能力下降的主要原因。

樹鼩; 睪丸; 精子; 形態(tài)結構; 冷凍損傷

樹鼩是一種晝行、樹棲的小型哺乳動物, 曾被定義為攀鼩目、靈長目(Liu et al, 2001; Wong & Kaas, 2009), 目前對樹鼩的分類地位仍然存在爭議。但無論如何, 樹鼩是最接近于靈長類的小型哺乳動物,具有許多靈長類動物共有的特征(Poonkhum et al, 2000)。樹鼩在人類醫(yī)學及生物學研究方面具有重要地位, 如神經生物學(Remple et al, 2007)、人類肝炎病毒感染(Xu et al, 2007; Li et al, 2008)、視覺系統發(fā)育(Poveda & Kretz, 2009)及群體階層應激(Kozicz et al, 2008; Zambello et al, 2010)等。目前, 有關雄性樹鼩生殖生物學研究的報道較少(Collins et al, 2007)。Collins et al于1982年報道了雄性樹鼩生殖道的解剖學特征和生理功能(Collins et al, 1982); 隨后, 有研究報道了雄性樹鼩從出生到性成熟過程的生殖器官生長與發(fā)育(Collins & Tsang, 1987); 精子細胞在睪丸內的成熟過程(Maeda et al, 1998); 雄性樹鼩精子的形成和染色質凝聚(Suphamungmee et al, 2008)等結果。然而, 樹鼩睪丸、精子形態(tài)結構特性的研究仍然很有限。我們曾報道樹鼩精子可以被冷凍保存(Ping et al, 2011), 但是精子冷凍后的超微結構變化尚不清楚。為此, 本研究分析樹鼩的睪丸、附睪精子的形態(tài)學結構特征, 以及樹鼩精子冷凍復蘇后的結構變化。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

4只健康的成年雄性樹鼩, 均來自中科院昆明動物研究所。所有實驗均在當年3—5月份完成。除特殊說明外, 所用化學試劑均購自Sigma公司(St. Louis, MO, USA)。精子稀釋液為TALP-HEPES (modified Tyrode’s solution with albumin, lactate and pyruvate) (Bavister et al, 1983), 冷凍液為TTE(Tris-TES-egg yolk)(Si et al, 2000), 均按照文獻中描述的方法配制。

1.2 實驗方法

1.2.1 睪丸的稱重和測量 氯胺酮(60～70 mg/kg體重)經肌肉注射, 待樹鼩麻醉后稱其體重。在麻醉狀態(tài)下, 外科手術暴露腹腔后取出睪丸、附睪及輸精管; 在附睪頭、尾相連處中間部分分離彼此, 并對上述各部分分別稱重; 游標卡尺測定睪丸的縱橫長度; 將分離得到的睪丸分別緩慢浸入含有3 mL生理鹽水的5 mL量筒中, 通過觀察量筒中液體體積的增加來確定睪丸的體積。

1.2.2 精子收集與分析 分離獲得的附睪尾和輸精管置于平皿中, 37 ℃TALP-HEPES洗滌; 隨后置于1 mL TALP-HEPES中剪至～1 cm, 用鑷子輕輕擠壓管腔以釋放儲存的精子; 微量移液器吸取所有精液, 混勻后取10 μL精液樣品檢測精子的數量、運動度和頂體完整性; 剩余的精子經離心處理后將沉淀精子固定, 用于超微結構分析。

精子計數和運動度測定 10 μL新鮮精子用TALP-HEPES稀釋100～500倍后取10 μL滴加到已預熱至37 ℃的血細胞計數板上, 在光學顯微鏡下計數前向運動精子和原地不動精子, 用二者數量之和計算每只樹鼩獲得精子數量; 運動精子占所有計數精子的百分比即為精子運動度, 其操作步驟參考文獻報道(Saragusty et al, 2009)。每次至少計數200個精子, 重復兩次。

頂體完整率檢測 熒光染料FITC-PNA檢測精子的頂體完整率, 其操作步驟見文獻報道(Ping et al, 2011)。簡要描述如下：精子樣品在TALP-HEPES中2 500 r/min、5 min離心和洗滌2次, 并稀釋至～1×105個/mL; 取20 μL滴在載玻片上, 自然風干后,在通風櫥中用甲醇溶液浸泡固定5 min; 載玻片取出風干后, 加入40 μg/mL FITC-PNA 40 μL于精子樣品上并在37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min; PBS(pH 7.2)洗去多余的染料, 在熒光顯微鏡下檢查,其激發(fā)光波長和發(fā)射光波長分別為490和515 nm。頂體完整的精子均勻地著上蘋果綠色, 而頂體不完整的精子部分著色或不著色。計數頂體完整和不完整的精子, 每次至少計數200個, 頂體完整精子占所有計數精子的比率為精子頂體完整率。

1.2.3 精子冷凍程序 冷凍方法參照Ping et al (2011)。從雄性樹鼩附睪中獲取精子, 離心洗滌后TTE稀釋至濃度為4×106個/mL; 將其置于4 ℃冰箱中進行預冷處理, 直至精子混合液降到4 ℃; 將精子混合液裝入0.25 mL冷凍麥管, 水平放置在15 cm×10 cm的鋁架上并將鋁架懸掛在離液氮面4 cm的位置上平衡10 min; 隨后將冷凍麥管投入液氮中冷凍保存。冷凍保存2 d后, 取出麥管, 直接投入37 ℃水浴中解凍; 解凍后將精子釋放到1.5 mL離心管中, 并用5×精液體積的TALP-HEPES稀釋;隨后以2 500 r/min、5 min離心洗滌1次, 將沉淀精子按電鏡樣品的制作方法處理。

1.2.4 電鏡樣品的處理與觀察 掃描電鏡樣品的處理方法參照文獻（Simeo et al, 2010)報道進行。簡述如下：冷凍?復蘇精子的沉淀中加入2.5%戊二醛PBS緩沖液(0.1 mol/L, pH 7.4, 4 ℃), 4 ℃前固定24 h; PBS緩沖液輕輕漂洗6次, 其中前3次每次10 min,后3次每次20 min; 質量分數為1%～2%的鋨酸4 ℃后固定1 h; 雙固定后, PBS緩沖液漂洗3次, 其中前2次每次5 min, 后1次30 min; 系列酒精逐級脫水; 冷凍干燥處理, 以及離子濺射儀噴金; 掃描電子顯微鏡觀察精子外部形態(tài)結構并拍照和分析。

透射電鏡樣品的處理 樣品處理也參照文獻（Simeo et al，2010)報道進行。簡述如下：冷凍?復蘇精子的沉淀中加入2.5%戊二醛PBS緩沖液(0.1 mol/L, pH 7.4), 4 ℃前固定24 h; PBS緩沖液漂洗6次, 其中前3次每次10 min, 后3次每次20 min; 質量分數為1%的鋨酸4 ℃后固定1 h; 雙固定后, PBS緩沖液漂洗3次, 其中前2次每次5 min, 后1次30 min; 梯度酒精、丙酮逐級脫水; Epon618環(huán)氧樹脂滲透、包埋、半切片、光鏡定位、修塊; Lecia-R超薄切片機切片(切片厚約90 nm); 切片經檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重染色后用透射電子顯微鏡觀察精子超微結構并拍照和分析。

2 結 果

2.1 樹鼩睪丸和附睪精子的形態(tài)與特征

測定結果見表1。

表1 樹鼩睪丸大小及附睪精子特征Tab. 1 Testis measurements and sperm characteristics of tree shrew

2.2 樹鼩精子的超微結構

新鮮樹鼩精子超微結構見表2。

樹鼩精子由頭、尾部組成, 尾部是精子最長的部分, 可分為中段、主段和末段等三部分(表2和圖1A, B)。在掃描電鏡下, 精子頭部呈圓形或卵圓形;精子尾部明顯分為中段(mid-piece, MP)、主段(principal piece, PP)和末段(end piece)。在透射電鏡下, 整個精子由質膜包裹, 其中頭部頂體區(qū)域的質膜連接呈松弛狀態(tài); 頭部由核、頂體和后頂體鞘組成; 頂體為一位于頭頂部的薄層帽狀囊腔; 頂體和核之間存在頂體下間隙(subacrosomal space, SAS);核由核膜包被, 為頭部的主要組成部分, 占據頭部的絕大部分體積, 其電子密度大而均勻; 核膜外為電子密度小而均勻的頂體; 由頭后端向前端, 核膜逐漸變薄, 在赤道段區(qū)域最堅固(圖1C, D)。

頭部核末端有一個凹面植入窩, 與頸部的小頭嵌合; 頸部, 又稱連接段, 由小頭、節(jié)柱和近端中心粒組成; 小頭的凸型致密纖維板結構, 與核末端的植入窩基板線相吻合; 稀疏、適度的電子致密物質填充在基板線和小頭的間隙里(圖1C)。

表2 樹鼩精子細胞的形態(tài)測定參數Tab. 2 Morphometry of epididymal sperm of tree shrew

圖1 樹鼩精子的超微結構Fig. 1 Tree shrew sperm morphology

尾主要由軸絲和外周致密纖維組成; 軸絲起于精子頸部, 延伸至尾部末段; 軸絲由9對雙聯體周圍微管和一對中央微管組成, 9對雙聯體周圍微管均勻環(huán)繞在中央微管周圍, 形成了“9+9+2”的微管構造; 每一對雙聯體均由一個小的圓柱狀微管和一個不完整C形微管組成; 從中心微管到周圍微管呈現放射狀延伸, 一對中心微管由一個短橋連接。在尾部中段和主段, 軸絲均有9根外周致密纖維環(huán)繞,每一根外周致密纖維伴隨一對雙聯體微管; 纖維橫截面呈現花瓣狀、黃豆狀或圓形。以中心微管軸絲為基準將外周致密纖維按順時針方向編號1～9, 結果發(fā)現外周致密纖維大小不同：尾部中段, 1、2、5、6外周致密纖維明顯較其他纖維粗; 尾部主段, 1、5、6外周致密纖維也明顯較其他纖維粗; 尾部中段靠近頸部的纖維較粗, 主段靠近尾部末段的纖維較細(圖1E?H)。

外周致密纖維在尾部中段由線粒體鞘環(huán)繞, 在主段由纖維鞘環(huán)繞。在尾部中段, 線粒體頭尾相接形成一個螺旋環(huán)繞致密纖維; 精子線粒體螺旋數為48; 在線粒體鞘的末端有一個三角狀環(huán), 連接質膜基底和向內突出的致密纖維頂端; 環(huán)位于螺旋狀線粒體末端和主段纖維鞘前端之間, 為中段和主段的分界線。纖維鞘從精子主段延伸到末段, 其電子密度高, 且越靠近末端越細, 直至消失; 纖維鞘由背、腹側縱柱及其環(huán)形連接肋柱組成, 且這兩個縱柱似乎固定在外周致密纖維3和8上(圖1E?G)。

2.3 冷凍復蘇精子形態(tài)結構的變化

鮮精精子運動度和頂體完整率分別為(68.82±3.95)%和(89.99±2.14)%, 解凍后精子復蘇運動度和頂體完整率分別為(44.73±3.67)%和(76.52±1.84)%。 FITC-PNA熒光染色后, 可見經冷凍/解凍, 部分精子的頂體表現出部分或完全缺失(圖2A); 精子頭部核表面的頂體不勻稱, 表明經冷凍/解凍后, 精子頂體結構出現損傷(圖2 B,C); 精子頭部核表面無可見頂體, 表明頂體完全缺失(圖2D)。

圖2 冷凍/解凍精子頭部頂體的缺損Fig. 2 Sperm acrosome defects after freezing and thawing

經過冷凍/解凍處理后, 精子膜結構變化主要表現在以下幾個方面(圖2)：頭部頂體處質膜破損;頭部和頸部連接處質膜缺失; 尾部中段線粒體鞘外質膜缺失; 尾部主段質膜缺失; 線粒體膜不完整。

在冷凍/解凍過程中, 外來冷凍壓力會造成精子的機械性損傷, 導致其不完整結構。頭、頸部斷裂致頭、尾部分離(圖4A, E); 尾部中段、主段斷裂;尾部主段、末段斷裂(圖4B?D)。

圖3 冷凍/解凍精子質膜的缺損Fig. 3 Sperm plasma membrane defects after freezing and thawing

圖4 冷凍/解凍精子不同部位間的斷裂Fig. 4 Sperm breakage in different locus after freezing and thawing

冷凍/解凍對精子的另一個損傷體現于尾部的彎曲度。精子尾部彎曲通常發(fā)生于中段或主段(圖5), 致使主段和中段的線粒體被同一質膜包裹, 造成軸絲結構受損, 進而導致精子運動功能喪失。

圖5 冷凍/解凍精子尾部的彎曲Fig. 5 Coiled sperm tail after freezing and thawing

解凍過程中, 滲透性防凍劑致使胞內滲透壓高于胞外, 胞外水向胞內流入, 有可能進而導致細胞膨脹, 如精子尾部中段膨脹(圖6)。

4 討 論

與哺乳動物及靈長類精子相似, 樹鼩精子頭部呈卵圓形(Downing et al, 2005)。不同物種精子頭部的長度和寬度各不相同, 如人類為4.5 μm和3 μm (Pedersen, 1969), 黑熊為6.57 μm和4.76 μm (Brito et al, 2010), 而樹鼩為6.65 μm和5.82 μm。樹鼩精子全長為73.05 μm, 與眼鏡熊和河貍精子長度相似(Gage, 1998; Bierla et al, 2007), 但與倉鼠(119 μm) (Nagy, 1994)和人類(55～60 μm)差異顯著。另外,由于擠壓釋放附睪尾和輸精管中的精子, 所計算的精子總數可能存在差異, 但損失精子比例可能很小。

圖6 冷凍/解凍精子尾部中段的膨脹Fig. 6 Swollen sperm tail mid-piece after freezing and thawing

線粒體鞘在精子尾部中段呈螺旋形包繞外周致密纖維, 不同物種動物精子尾部中段的線粒體螺旋數各異：人類為15個; 倉鼠為133個(Nagy, 1994);黑熊為59個(Gage, 1998), 而樹鼩為48個。

軸絲由與精子運動密切相關的微管組成。不同物種動物精子尾部的軸絲結構不同, 樹鼩精子的軸絲結構類似于人類、蟹、長鼻浣熊、野豬及蜜蜂, 即為“9+9+2”型(EI-Shoura et al, 1995; Báo et al, 2004; Fischman et al, 2009; Lima et al, 2009; Mancini et al, 2009)。

哺乳動物冷凍精子的受精率和受孕率較鮮精為低(O'Meara et al, 2005), 因為在冷凍過程中, 精子經受著許多外來壓力的考驗, 如冷休克、膜相轉換、冰晶形成等(Aboagla & Terada, 2004; White, 1993)。冷休克會導致部分精子運動能力喪失、膜結構損傷(Jones & Martin, 1973; Ortman & Rodriguez-Martinez, 1994)及線粒體膜電位改變(Watson, 1995)。冷凍時, 由于細胞外冰晶形成將造成胞外液體滲透壓升高, 促使細胞內水分外排, 導致細胞收縮, 如細胞膜不能承受如此劇烈的收縮變化, 將出現細胞損傷; 而解凍時, 胞外水的流入又可致使細胞破裂(Mazur, 1984)。在對樹鼩冷凍/解凍精子超微結構的觀察和分析中發(fā)現：樹鼩精子冷凍/解凍后, 質膜和頂體最容易受到損傷, 其頂體會完全缺失或損傷;無論在頭部還是尾部中段和主段, 質膜均有可能腫脹、變薄、破損、甚至缺失。同時, 解凍時, 胞內的滲透性防凍劑將導致胞內滲透壓高于胞外, 細胞吸水, 進而使得細胞因滲透壓梯度作用而表現為不均一膨脹, 如部分精子尾部中段膨脹。再者, 由于機械性壓力影響，很容易導致樹鼩精子頭、頸部斷裂, 尾部中段、主段斷裂, 造成精子的致死性損傷。由此可見, 質膜和頂體完整性受損仍然是導致樹鼩冷凍/解凍精子受精率低下的主要原因。

因此, 通過研究樹鼩精子的超微結構及冷凍對超微結構的影響, 有助于改善現有的樹鼩精子冷凍方法和提高樹鼩的人工繁殖能力, 為低溫生物學發(fā)展提供理論依據。

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Morphological characteristics and cryodamage of Chinese tree shrew (Tupaia belangeri chinensis) sperm

ZHANG Yuan-Xu1,2, PING Shu-Huang1, YANG Shi-Hua1,*

(1. Laboratory of Molecular Genetics of Aging and Tumor, Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China; 2. Key Laboratory of Animal Models and Human Disease Mechanisms of the Chinese Academy of Sciences & Yunnan Province, Kunming Institute of Zoology, Kunming 650223, China)

The tree shrew (Tupaia belangeri chinensis) is a small non-rodent mammal, which is a relatively new experimental animal in medicine due to its close evolutionary relationship to primates and its rapid propagation. Sperm characteristics and cryopreservation in the tree shrew were the main contents of our spermatological research. Epididymal sperm were surgically harvested from male tree shrews captured from the Kunming area. The rate of testis weight to body weight was (1.05±0.07)%, volume of both testis was (1.12±0.10) mL, total sperm from epididymis and vas deferens were 2.2?8.8×107, and sperm motility and acrosome integrity were (68.8±3.9)% and (90.0±2.1)%, respectively. Sperm ultrastructure of the tree shrew was examined by scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Tree shrew sperm had a round or oval shaped head of approximately 6.65×5.82 μm, and midpiece, principal piece, tail, and total sperm lengths were 13.39, 52.35, 65.74, and 73.05 μm, respectively. The mitochondria in the midpiece consisted of approximately 48 gyres and had a 9+9+2 axonemal pattern. After freezing and thawing, sperm showed partly intact acrosomes and plasma membrane defects, and sperm breakages, twists, and swellings were found. The tree shrew had similar ultrastructure with other mammalians except for the mitochondria number and the sperm size. Ultrastructural alteration is still the main cause resulting in poor sperm after cryopreservation.

Tree shrew; Testis; Sperm; Morphological structure; Cryo-damage

張遠旭,男,碩士研究生,主要從事疾病動物模型研究

Q418; Q954.43

A

0254-5853-(2012)01-0029-08

10.3724/SP.J.1141.2012.01029

2011-11-01；接受日期：2011-12-31

國家自然科學基金(31071279)

?通信作者(Corresponding author)，E-mail: huashiyang@hotmail.com