陳俊玉 方成俊 何建順

（1.東山出入境檢驗(yàn)檢疫局 福建東山 363401；2.中國(guó)檢驗(yàn)認(rèn)證集團(tuán)廈門有限公司漳州分公司 福建漳州 363000）

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是結(jié)合了抗原抗體的特異性反映和酶的高效催化顯色反映而形成的一種檢測(cè)方法，具有特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便易學(xué)、所需設(shè)備較少等優(yōu)點(diǎn)，適合于批量樣品的篩選檢測(cè)，目前廣泛用于藥物殘留快速初篩檢測(cè)。本文結(jié)合ELISA法在動(dòng)物源性食品中氯霉素殘留量檢測(cè)中的應(yīng)用，參照國(guó)際計(jì)量局（BIPM）關(guān)于試驗(yàn)不確定度評(píng)定方法的建議書和JJF1059-1999《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》規(guī)范，就檢測(cè)結(jié)果不確定度情況進(jìn)行分析評(píng)定。

1 ELISA檢測(cè)中不確定度來(lái)源

檢測(cè)中不確定度的來(lái)源：（1）取樣帶來(lái)的不確定度。（2）被測(cè)樣品由于提取或分離不完全帶來(lái)的不確定度。（3）在測(cè)量過(guò)程中環(huán)境條件的影響帶來(lái)的不確定度。（4）稱量和容量?jī)x器的不確定度。（5）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所給定的不確定度以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在使用過(guò)程中產(chǎn)生的變化而引起的不確定度。（6）在測(cè)量方法和過(guò)程中的某些近似和假設(shè)。（7）檢測(cè)人員讀數(shù)不準(zhǔn)或操作中的隨機(jī)誤差帶來(lái)的不確定度。

2 材料和方法

2.1 試劑和設(shè)備 氯霉素酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒、酶標(biāo)儀、電子天平、瓶口移液器、單通道微量移液器。

2.2 檢測(cè)過(guò)程（按照SN/T1604-2005）

3 ELISA法檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氯霉素殘留量中的不確定度評(píng)定

3.1 稱樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（稱樣）rel稱取樣品3.0 g，為計(jì)算方便，設(shè)實(shí)際稱重為3.00 g。稱量天平稱量不確定度主要為稱量變動(dòng)性，根據(jù)電子天平技術(shù)參數(shù)，其變動(dòng)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01 g，按照均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01/31/2＝0.0058，則稱樣的相對(duì)不確定度為：U c（稱樣）rel＝0.0058/3.00＝0.00193。

3.2 樣品稀釋液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（樣品）rel 3.2.1 乙酸乙酯純度的不確定度Uc（乙酸乙酯）rel乙酸乙酯純度為（99.5±0.5）%，按均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差，即相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（乙酸乙酯）rel＝0.005/31/2＝0.00289。

3.2.2 移取乙酸乙酯的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（提取液）rel用瓶口移液器取1次6 mL乙酸乙酯，根據(jù)瓶口移液器的檢定結(jié)果為0.003 mL，按照平均分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差，即相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（提取液）rel＝0.003/31/2＝0.00173。

3.2.3 稀釋樣品帶來(lái)的不確定度Uc（稀釋）rel用單通道微量移液器取1.0 mL稀釋緩沖液，根據(jù)單通道微量移液器的技術(shù)指標(biāo)和檢定結(jié)果，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為 0.0024，即 Uc（稀釋）rel＝0.00240。

將以上三個(gè)項(xiàng)目合成，則Uc（樣品）rel＝（0.002892＋0.001732＋0.002402）1/2＝0.00414。

3.3 ELISA試驗(yàn)操作過(guò)程的不確定度Uc（試驗(yàn)）rel

3.3.1 微量移液器加樣Uc（加樣）rel用單通道微量移液器加樣50 uL（整個(gè)試驗(yàn)每孔均只加樣1次）所帶來(lái)的相對(duì)不確定度為Uc（加樣）rel＝0.00240。

3.3.2 反應(yīng)溫度帶來(lái)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（溫度）rel使用低溫生化培養(yǎng)箱來(lái)獲得ELISA的底物溫度25℃，根據(jù)低溫生化培養(yǎng)箱技術(shù)指標(biāo)，溫度波動(dòng)范圍為±1.0℃，按照均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0/31/2＝0.58 ℃，則 Uc（溫度）rel＝0.58/25＝0.0232。

3.3.3 反應(yīng)時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（時(shí)間）rel在ELISA試驗(yàn)過(guò)程中，反應(yīng)時(shí)間也可能產(chǎn)生不確定度。根據(jù)日常試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，取反應(yīng)時(shí)間變動(dòng)范圍為±30 s。根據(jù)均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為30/31/2＝17.3 s，則Uc（時(shí)間）rel＝［（17.3/（60×60））2+（17.3/（30×60））2］1/2＝0.0108。

將上述三項(xiàng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成，得到Uc（試驗(yàn)）rel＝（0.002402＋0.02322＋0.01082）1/2＝0.0257。

3.4 酶標(biāo)儀讀數(shù)相對(duì)不確定度Uc（酶標(biāo)儀）rel從Labsystems-MK3酶標(biāo)儀在1～1.5吸光度單位內(nèi)的不確定度為 0.5%，則 Uc（酶標(biāo)儀）rel＝0.005。

3.5 數(shù)據(jù)處理帶來(lái)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（計(jì)算）rel因在檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)處理中，需根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，在這過(guò)程中，所用的標(biāo)準(zhǔn)曲線是被假設(shè)成真實(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，也就帶來(lái)了數(shù)據(jù)處理方面的不確定度，可用標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)來(lái)反映，根據(jù)檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)，r＝0.990，則 Uc（計(jì)算）rel＝0.010。

3.6 合成不確定度Uc（合成）rel將3.1-3.5各項(xiàng)分相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度進(jìn)行合成，則得到ELISA法檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氯霉素含量的合成不確定度：

3.7 展伸不確定度（總不確定度） 取包含因子K＝3（置信水平＝0.997），則：

總不確定度 UC＝K×Uc（合成）rel＝3×2.84%＝8.52%。

4 結(jié)論

從上述不確定度分析可以看出，按照SN/T1604-2005用ELISA法對(duì)動(dòng)物源性食品中氯霉素含量進(jìn)行檢測(cè)，在置信水平P為0.997時(shí)，其相對(duì)不確定度為8.52%，與其他分析方法的相對(duì)不確定度比較而言較大，主要與ELISA法本身特性有關(guān)：（1）ELISA法結(jié)合了抗原抗體的免疫反映和酶的高效催化反應(yīng)，檢測(cè)限較低，特異性好，方便使用于檢測(cè)痕量物質(zhì)，而痕量物質(zhì)的檢測(cè)必然伴隨較大不確定度。（2）ELISA法檢測(cè)需使用多種生化、免疫學(xué)及分子生物學(xué)試劑，如抗原、抗體、底物TMB等，這些試劑本身所具有的不穩(wěn)定性對(duì)檢測(cè)結(jié)果也相應(yīng)帶來(lái)較大的直接影響。（3）用ELISA法檢測(cè)時(shí)還受到反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、洗滌效果、人員操作等其他因素的影響，這也是不確定度的重要來(lái)源。

［1］ 國(guó)家技術(shù)質(zhì)量監(jiān)督局.JJF1059-1999測(cè)量不確定度評(píng)定與表示［S］.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，1999.

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