井趙斌，俞 靚，魏 琳，程積民，，3

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌712100；3.中國科學(xué)院水利部水土保持研究所，陜西 楊凌712100）

本氏針茅（Stipabungeana）為禾本科（Gramineae）針茅屬多年生草本植物，又叫長芒草，俗稱蓑草，廣泛分布于我國西北、華北、西南和東北各地，亞洲中部及北部也有分布，是黃土高原典型草原的代表性植物和優(yōu)勢種植物。其根系發(fā)達，須根較多，草質(zhì)柔軟，營養(yǎng)豐富，適口性好，是一種牲畜較喜食的天然牧草，同時又是優(yōu)良的水土保持植物［1］。以本氏針茅為優(yōu)勢種和建群種的典型半干旱氣候帶的云霧山草原自然保護區(qū)為我國黃土高原保留最完整、面積最大、原生性最強的典型區(qū)域。國內(nèi)外對針茅屬植物分子水平的研究較多，但國內(nèi)對本氏針茅光合生理生態(tài)學(xué)方面的研究報道較少［1-6］，尚未見基于分子生物學(xué)基礎(chǔ)的研究報道。

基于DNA分子水平上的植物遺傳多樣性和遺傳分化在物種多樣性保護中的作用已得到公認。目前，對林草的遺傳多樣性研究由以瀕危稀有物種為主逐漸向以優(yōu)勢種和建群種并重發(fā)展，優(yōu)勢種和建群種遺傳多樣性的研究不但對物種的保護和利用具有重要意義，而且可以為生態(tài)系統(tǒng)遺傳健康的評估提供基礎(chǔ)。國內(nèi)外對針茅屬植物遺傳多樣性的研究已有較多報道［7-12］，已有的研究基本上以內(nèi)蒙古草原為主體，對全國其他生態(tài)分布區(qū)的研究基本上屬于空白，研究所用的標記以 RAPD［9-11］和ISSR［13］標記為主。SRAP標記（Sequence-Related Amplified Pol y mor phis m，相關(guān)序列擴增多態(tài)性）是由Li和Quiros［14］于2001年開發(fā)的一種基于PCR的新型隨機引物標記系統(tǒng)。目前，SRAP標記已被成功用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位分析、品種鑒定和雜種優(yōu)勢等的研究中，結(jié)果表明較RAPD、SSR、ISSR、AFLP等標記具有更豐富的多態(tài)性且操作簡便、重復(fù)性高、成本較低，特別是對序列信息未知的物種省去了開發(fā)引物的過程［15-17］。

本研究以黃土高原區(qū)本氏針茅為材料，在建立適于本氏針茅DNA提取方法的基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計和單因素分析相結(jié)合的方法對SRAP反應(yīng)體系進行優(yōu)化，在最優(yōu)反應(yīng)體系建立的基礎(chǔ)上對部分SRAP引物進行了多態(tài)性篩選，以期為利用SRAP標記進一步開展本氏針茅種質(zhì)資源遺傳多樣性研究和黃土高原植被恢復(fù)及生態(tài)建設(shè)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料于2010年7-9月采自陜西、寧夏、內(nèi)蒙古和甘肅不同生態(tài)分布區(qū)（表1）。采樣時同一生態(tài)區(qū)不同個體之間的距離保持在10 m以上，每個樣品選取幼嫩無病斑葉片，采集編號后裝塑料袋密封，置冰盒中帶回實驗室，存于-80℃冰箱中備用。優(yōu)化體系材料為采集于陜西銅川和寧夏固原云霧山的本氏針茅資源，編號分別為SX-1-TC-1和NX-1-Y WS-1，單因素篩選試驗材料為陜西銅川本氏針茅，編號為SX-1-TC-1，體系驗證材料為甘肅、寧夏和內(nèi)蒙古選出的8個采樣點中的8個單株，編 號 分 別 為 GS-1-HX-1、NX-2-XJ-1、NX-3-H MS-1、NX-4-HC-1、NX-5-Y WS-1，NX-6-LPS-1、NMG-1-ETC-1和NMG-2-ETC-1，引物篩選從4個省區(qū)中各選取1個采樣點（不同生態(tài)區(qū)）中的1個單株，編號分別為 SX-2-JB-1、NMG-3-ETC-1、NX-7-YC-1和GS-2-JY-1。

表1 供試材料Table 1 List of experi mental materials

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及檢測 取采集的本氏針茅幼嫩葉片，參考文獻［18］的方法略作修改后提取基因組DNA。分別用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度后，稀釋工作液至20 ng·μL-1，保存母液和工作液于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化 SRAP引物參考 Guo和Luo［19］、Ferriol等［20］和 Budak等［21］發(fā)表的引物序列，共17條正向引物和21條反向引物（表2），引物由上海捷瑞生物工程公司合成。用于體系優(yōu)化的引物組合為Me1＋Em1（材料：SX-1-1）和 Me2＋Em6（材料：NX-1-Y WS），體系驗證的引物組合為Me3＋Em1（材料：GS-1-HX-1、NX-2-XJ-1）、Me5＋Em2（材 料：NX-3-H MS-1、NX-4-HC-1）、Me6＋Em5（材料：NX-5-Y WS-1、NX-6-LPS-1）、Me12＋Em9（材料：NMG-1-ETC-1、NMG-2-ETC-1）。

表2 引物序列Table 2 Sequence of pri mers

PCR反應(yīng)程序采用復(fù)性變溫法：94℃預(yù)變性5 min；前5個循環(huán)為94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min；后35個循環(huán)僅將復(fù)性溫度變?yōu)?0℃；循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴增在Eppendorf PCR儀上進行。

采用L16（45）正交試驗設(shè)計，對影響SRAPPCR反應(yīng)的主要5個因子：DNA、Taq酶、d NTPs、Mg2＋和引物進行5因素4水平的優(yōu)化篩選試驗，重復(fù)2次（2對引物組合2個材料），各反應(yīng)組分的因素水平正交試驗見表3。反應(yīng)體系總體積為20μL，其中10×Buffer為2.5μL，其他各組分按照表2加入，不足體積用dd H2O補足。以正交試驗結(jié)果選出的最優(yōu)體系為基礎(chǔ)，對5個主要因子設(shè)置8個不同的濃度梯度處理（表4），在其他因子濃度保持不變的情況下按照8個梯度變化單個因子，逐個篩選出各個因子的最佳反應(yīng)濃度。擴增產(chǎn)物用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯影，照相統(tǒng)計結(jié)果。

表3 SRAP-PCR反應(yīng)中各試驗組分因素水平L 16（4 5）正交試驗設(shè)計Table 3 Factor and level of SRAP-PCR by orthogonal design［L 16（4 5）］

表4 SRAP-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化單因素篩選試驗Table 4 Optimal concentration gradient of each factor in SRAP-PCR system mL

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 SRAP-PCR正交試驗設(shè)計和單因素篩選試驗最優(yōu)反應(yīng)體系擴增結(jié)果的選擇采用直觀法和統(tǒng)計分析法進行分析。直觀法主要根據(jù)擴增條帶數(shù)量、清晰度以及背景對16個處理進行直觀分析。統(tǒng)計分析法采用鄭軼琦等［22］方法分別計算出某水平下某因子參與反應(yīng)所產(chǎn)生的擴增條帶總數(shù)（Ki），某因子在某水平參與反應(yīng)所產(chǎn)生的擴增條帶的平均值（Xi）以及某因子在不同水平下最大平均值與最小值平均值之差（極差R），最后確定選出各個組分的最優(yōu)水平。

1.2.4 SRAP-PCR優(yōu)化體系的驗證和確立 根據(jù)正交試驗設(shè)計和單因素分析優(yōu)化建立的最優(yōu)反應(yīng)體系，選取2個省份中8個采樣點中的共8份材料和4對隨機引物組合進行驗證，進一步確立適合于本氏針茅種質(zhì)資源遺傳多樣性SRAP分析的最優(yōu)反應(yīng)體系。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA提取 基因組DNA提取參考井趙斌［18］的SDS法提取本氏針茅DNA，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后在點樣孔處有亮帶聚集產(chǎn)生，表明有部分多糖物質(zhì)未去除干凈，且有拖尾現(xiàn)象，說明DNA嚴重降解，如圖1中樣品6、7、8和9；用紫外分光光度計檢測DNA濃度和質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)用SDS法提取的DNA其260 n m／280 n m處OD值均低于1.8，說明DNA中有蛋白質(zhì)污染，這些結(jié)果均表明用SDS法提取本氏針茅基因組DNA效果較差。隨后，在此方法的基礎(chǔ)上進行改進，將SDS提取液改為CTAB提取液［100 mmol·L-1Tris-HCL（p H 值8.0），1.4 mol·L-1Na Cl，50 mmol·L-1EDTA（p H 值8.0），2%CTAB及20μLβ-巰基乙醇］，再加入140 μL 20%的PVP充分混勻，同時增加了2個步驟（65℃水浴20 min和加無水乙醇后冰浴20 min）。用改良后的方法提取的DNA經(jīng)電泳檢測后，條帶整齊，沒有拖尾和降解現(xiàn)象出現(xiàn)，說明質(zhì)量很好，如圖1中樣品1、2、3、4和5；紫外分光光度計檢測結(jié)果表明，其OD值介于1.8～2.0，且濃度較高。本研究建立了適用于本氏針茅基因組DNA提取的改良CTAB法，用該方法提取的DNA經(jīng)SRAP-PCR檢測后，完全可以滿足試驗要求。

圖1 基因組DNA瓊脂糖電泳檢測結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA

圖2 SRAP-PCR正交試驗設(shè)計擴增結(jié)果電泳圖Fig.2 Amplification of SRAP-PCR by orthogonal design［L 16（4 5）］

2.2 SRAP-PCR正交試驗設(shè)計優(yōu)化體系結(jié)果分析 正交試驗設(shè)計1 6個組合的SRAP-PCR擴增結(jié)果如圖2所示。因正交試驗設(shè)計具有均衡分散的特點，SRAP-PCR反應(yīng)體系中各個試驗組分的濃度組合彼此不同，因此擴增結(jié)果具有明顯的差異（圖2），組合6、10、11、12、14和16擴增條帶數(shù)較低，且條帶比較微弱模糊；組合1、2、3、4和7擴增結(jié)果較好，但與組合5、8、9和13相比，條帶數(shù)較少且條帶之間界限較為模糊；組合5、8、9和13之間，擴增條帶數(shù)基本一致，組合8和13與組合5和9相比，如圖2中箭頭所示位置條帶很微弱且模糊；最后組合5和9進入候選。比較分析2個組合中各個組分的濃度差異，組合5中的模板DNA、d NTPs和引物用量都較組合9少，最后確定第5組合為SRAP-PCR正交試驗設(shè)計中的最優(yōu)組合，即在20μL總的反應(yīng)體系中，包括模板 DNA（20 ng·μL-1）2μL、Taq DNA 酶 （5 U·μL-1）0.2μL、d NTPs（2.5 mmol·L-1）1μL、引物（10μmol·L-1）1.5μL、Mg2＋（25 mmol·L-1）2.5μL、10×Buffer 2.5μL、dd H2O 8.8μL。

參考鄭軼琦等［22］方法，對正交試驗設(shè)計中各個組合進行統(tǒng)計分析（表5），極差值R的大小反映了某組分對試驗結(jié)果的影響，R值越大，影響越大。根據(jù)R值的大小，在設(shè)定的4個水平上，5個組分對擴增結(jié)果的影響由大到小依次為Taq DNA酶＞模板DNA＞引物＞d NTPs＞Mg2＋。X值反映了各組合中各水平對反應(yīng)體系的影響大小，X值越大，反應(yīng)水平越佳。從表5中X值結(jié)果來看，模板DNA以水平1為佳，Taq DNA酶以水平1為佳，d NTPs、引物和Mg2＋均以水平2為佳，即模板 DNA（20 ng·μL-1）2μL、Taq DNA 酶（5 U·μL-1）0.2 μL、d NTPs（2.5 mmol·L-1）1 μL、引 物 （10 μmol·L-1）1.5μL、Mg2＋（25 mmol·L-1）2.5 μL，該結(jié)果與直觀分析選出的最優(yōu)組合5最為接近，最終確定組合5為正交試驗設(shè)計中的最優(yōu)組合。為進一步獲得理想的反應(yīng)體系，在組合5的基礎(chǔ)上進行單因素篩選試驗，以微調(diào)各組分的用量建立更優(yōu)的SRAP-PCR反應(yīng)體系。

表5 SRAP-PCR正交試驗設(shè)計各處理統(tǒng)計分析Table 5 Result of SRAP-PCR by orthogonal design

2.3 SRAP-PCR單因素篩選

2.3.1 模板DNA最優(yōu)加入量的確定 合適的模板DNA加入量和質(zhì)量是影響PCR擴增結(jié)果的關(guān)鍵因素。在設(shè)置的8個DNA加入量中均有條帶產(chǎn)生，其中DNA加入量分別為1.5、2.0、2.5和3.5μL時，條帶數(shù)量和清晰度表現(xiàn)較差；在加入量分別為0.5、1.0、3.0和4.0μL時，均可擴增出清晰的條帶，但在3.0μL時條帶清晰度和背景最好（圖3），結(jié)合正交試驗結(jié)果綜合分析，確定20μL總反應(yīng)體積中模板DNA的用量以3.0μL為最佳。

圖3 模板DNA濃度對SRAP-PCR擴增結(jié)果的影響Fig.3 Effects of template DNA concentration on SRAP-PCR amplification

2.3.2 Mg2＋最優(yōu)濃度的確定 Mg2＋的濃度直接影響著引物退火和產(chǎn)物的特異性以及酶的催化能力和準確性。在加入量為0.4和0.8μL時，擴增條帶模糊，加入量在1.2～2.4μL時，背景清晰條帶豐富，當加入量大于2.4μL時條帶開始變微弱（圖4）。直觀分析總體上在加入量為2.0μL時擴增效果最優(yōu)。因此，確定20 μL總反應(yīng)體系中Mg2＋最優(yōu)加入量為2.0μL。

2.3.3 Taq DNA聚合酶最佳用量的確定 Taq DNA聚合酶的用量直接影響擴增反應(yīng)的成敗。8個Taq DNA聚合酶梯度都有擴增條帶，用量在0.1和0.3μL時，條帶較弱且缺失部分條帶；用量在0.5～0.8μL時，均可得到理想的擴增條帶；用量為0.2μL時，擴增產(chǎn)物全部出現(xiàn)（圖5），但是條帶稍有點微弱，結(jié)合正交試驗結(jié)果最終以0.2μL作為體系入選最佳用量。

圖4 Mg2＋濃度對SRAP-PCR擴增結(jié)果的影響Fig.4 Effects Mg2＋concentration on SRAP-PCR amplification

圖5 Taq DNA聚合酶濃度對SRAP-PCR擴增結(jié)果的影響Fig.5 Effects of Taq DNA poly merase concentration on SRAP-PCR amplification

2.3.4 引物最優(yōu)加入量的確定 引物加入量過高會引起非特異性擴增且易形成引物二聚體，而過低的引物加入量降低PCR擴增效率。從圖6可以看出，除加入量為0.2μL時幾乎沒有擴增產(chǎn)物外，其他均有較清晰條帶。結(jié)合正交試驗候選組合引物加入量，最后確定1.5μL的引物為20μL反應(yīng)體系中的用量。

圖6 引物加入量對SRAP-PCR擴增結(jié)果的影響Fig.6 Effects of pri mer concentration on SRAP-PCR amplification

2.3.5 d NTPs最優(yōu)加入量的確定 高加入量d NTPs可加速反應(yīng)，但同時增加錯誤摻入和試驗成本；低加入量可提高精確性，而反應(yīng)速度會降低。從d NTPs擴增結(jié)果（圖7）來看，除加入量在1.6μL時條帶微弱外，其他各梯度加入量均有擴增條帶且清晰度和數(shù)量基本一致，但比較發(fā)現(xiàn)加入量為1.4μL時條帶表現(xiàn)更清晰，結(jié)合正交試驗結(jié)果最終選擇1.4 μL為20μL反應(yīng)體系中的最佳加入量。

2.4 最優(yōu)反應(yīng)體系的驗證及多態(tài)性引物篩選根據(jù)SRAP-PCR正交試驗設(shè)計和單因素篩選試驗結(jié)果，得到本氏針茅SRAP標記的最優(yōu)反應(yīng)體系為20μL總的反應(yīng)體系中包括：DNA（20 ng·μL-1）3μL、Taq DNA 酶（5 U·μL-1）0.2 μL、d NTPs（2.5 mmol·L-1）1.4μL、引物（10 μmol·L-1）1.5μL、Mg2＋（25 mmol·L-1）2.0μL、10×Buffer 2.5μL、dd H2O 7.9μL。選取下列引物和材料進行最優(yōu)體系驗證：Me3＋Em1、Me5＋Em2、Me6＋Em5、Me12＋Em9。選取的4對引物組合在8份材料間均能擴增出很好的條帶，且多態(tài)性特別豐富（圖8）。選取4個省份差異較大生態(tài)區(qū)的材料4份對表2中組合的共357對引物進行SRAP-PCR擴增，共篩選出條帶整齊、背景清晰的多態(tài)性引物共85對，最后從85對多態(tài)性引物中選出更優(yōu)的20對進行本氏針茅遺傳多樣性分析。

圖7 d NTPs加入量對SRAP-PCR擴增結(jié)果的影響Fig.7 Effects of d NTPs concentration on SRAP-PCR amplification

圖8 SRPA-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系擴增結(jié)果驗證Fig.8 Validation of amplification result by optimal SRPA-PCA system

3 討論

3.1 本氏針茅基因組DNA提取方法 高質(zhì)量的DNA是影響PCR擴增成敗的關(guān)鍵因素，目前植物基因組DNA提取的方法已很成熟，但是不同植物體內(nèi)含有的蛋白質(zhì)、單寧、色素、酚類及多糖等物質(zhì)成分差異較大，一般直接參考已有的方法不易成功。本氏針茅屬于多年生草本植物，不同生態(tài)和地理分布區(qū)的植株持水量差異很大，本研究在提取本氏針茅基因組DNA過程中發(fā)現(xiàn)采集于荒漠草原類型區(qū)的樣品，其葉片中含有的纖維物質(zhì)特別多，不易研磨而直接影響了提取的DNA質(zhì)量。基因組DNA提取開始時，直接參考用于水稻（Or yzasativa）基因組DNA提取的SDS法，電泳結(jié)果表明DNA全部降解，原因可能和研磨過程中未加液氮和葉片持水量較低有關(guān)。經(jīng)過幾次改進后，得到了適于本氏針茅基因組DNA提取的改良CTAB法，該方法具有提取DNA質(zhì)量好、濃度高、時間短和易于操作等優(yōu)點。SRAP-PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明，用改良的CTAB法提取的基因組DNA完全可以滿足本氏針茅遺傳多樣性分析的要求。

3.2 正交試驗設(shè)計和單因素分析法及其在PCR反應(yīng)體系優(yōu)化中的應(yīng)用 PCR反應(yīng)體系的合適與否直接影響PCR擴增多態(tài)性位點的數(shù)量及遺傳多樣性結(jié)果的精確性，因此建立一個適宜的PCR反應(yīng)體系是進行遺傳多樣性研究的首要條件。目前，應(yīng)用于PCR體系優(yōu)化的方法較多，其中以正交試驗設(shè)計和單因素法應(yīng)用最多，且在許多牧草PCR反應(yīng)體系優(yōu)化試驗中得到了應(yīng)用［19-20］。正交試驗設(shè)計是統(tǒng)計數(shù)學(xué)的重要分支，運用這種方法可以達到減少試驗次數(shù)，縮短試驗周期，降低試驗和生產(chǎn)成本，迅速找到優(yōu)化方案，實現(xiàn)最大效益的目的；但該方法也有一定的局限性，如對試驗結(jié)果本身優(yōu)劣的判斷具有主觀性，不能很好地估計試驗誤差，也不能表明各試驗因素水平的交互作用［22］。單因素分析法可直觀快速地得到該因素對擴增程序的影響，但是忽略了各因素間的相互作用［23］。正交試驗設(shè)計和單因素分析法相結(jié)合可以彌補彼此的缺點。前人［13，23］已發(fā)表的PCR體系優(yōu)化報道基本上以單一的正交試驗設(shè)計或者單因素分析法為主，本研究在正交試驗設(shè)計的基礎(chǔ)上，進一步對主要試驗因素設(shè)置的合理濃度梯度進行微調(diào)，得到了更優(yōu)的SRAP-PCR反應(yīng)體系，其增效果表現(xiàn)更好。目前，基本上以直觀法和統(tǒng)計分析法為標準對PCR體系優(yōu)化試驗結(jié)果進行評價分析，這2種方法的共同缺點是對結(jié)果的分析帶有個人主觀性，在擴增條帶結(jié)果統(tǒng)計過程中難免會有人為設(shè)置標準的誤差，所以更加科學(xué)和完善的評價分析方法亟需研究建立。

3.3 其他因素對PCR反應(yīng)體系的影響 模板DNA、Taq DNA聚合酶、d NTPs、Mg2＋和引物是影響PCR反應(yīng)體系的主要因素，各個因素的主要作用及其之間的互作已有較多報道［19-20］。本研究在反應(yīng)體系建立后，將Taq DNA聚合酶、d NTPs、Mg2＋和10×Buffer進行了更換（不同生產(chǎn)商），結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同的體系在不同的產(chǎn)品之間可以進行擴增，但是結(jié)果因產(chǎn)品質(zhì)量不同會產(chǎn)生差異，如擴增條帶數(shù)量和清晰度等；同時對其他組分和條件完全相同而采用不同公司合成的相同引物序列進行比較研究后發(fā)現(xiàn)，結(jié)果差異較大，所以引物合成質(zhì)量的優(yōu)劣是決定多樣性豐富的一個關(guān)鍵因素。體系驗證是對最優(yōu)反應(yīng)體系適宜性的進一步分析，因此應(yīng)把選擇不同生態(tài)和地理分布區(qū)的材料作為一個關(guān)鍵因素考慮，這樣對最優(yōu)反應(yīng)體系在差異較大材料間的廣適性可以得到更加精確的結(jié)論。

4 結(jié)論

本研究建立了適合本氏針茅基因組DNA提取的改良CTAB法，并在此基礎(chǔ)上建立了本氏針茅SRAP-PCR反應(yīng)體系，即在20μL總的反應(yīng)體系中包括：DNA（20 ng·μL-1）3μL、Taq DNA 酶（5 U·μL-1）0.2μL、d NTPs（2.5 mmol·L-1）1.4 μL、引 物 （10 μmol·L-1）1.5 μL、Mg2＋（25 mmol·L-1）2.0μL、10×Buff er 2.5μL、dd H2O 7.9μL，該體系經(jīng)PCR擴增檢測能很好地用于遺傳多樣性研究中。

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