劉 剛，殷 浩，佟萬(wàn)紅，黃蓋群，王 麗，危 玲，鄭繼川，夏慶友

（1.西南大學(xué)蠶學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)研究所，重慶400716；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，四川 南充637000；3.四川省林業(yè)科學(xué)院，四川 成都610066；4.四川省蠶業(yè)科技開(kāi)發(fā)總公司，四川 南充637000）

1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojimycin，DNJ）是一種哌啶類生物堿，一種高效的α-糖苷酶抑制劑，具有顯著降血糖的功效［1-3］。而目前所知的天然植物中，桑樹(shù)（Morusalba）中 DNJ含量最高［4］，而且桑樹(shù)的主要產(chǎn)物——桑葉，其DNJ含量約為0.1%，是降血糖天然藥物開(kāi)發(fā)的優(yōu)質(zhì)原料。大量學(xué)者［5-12］對(duì)桑葉中的DNJ進(jìn)行了廣泛的研究，但大多僅限于其含量，而作為植物生長(zhǎng)及代謝的重要因素——肥料卻少見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，尤其是配方施肥對(duì)桑葉DNJ含量及其總產(chǎn)量的影響，迄今尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

基于此，本試驗(yàn)初步探討了“3414”配方施肥對(duì)桑葉DNJ含量和產(chǎn)量的影響，并擬合肥料效應(yīng)函數(shù)，獲得推薦施肥參數(shù)，以期為建設(shè)DNJ高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)桑園提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和DNJ的測(cè)定方法

1.1.1 試劑 1-deoxynojirimycin-HCl（DNJ-HCl）為Sigma公司產(chǎn)品；9-Fluorenylmethyl chlorofor-mate（FMOC-Cl）為Fluca公司產(chǎn)品；乙腈色譜純?yōu)樘旖蚴袆P通化學(xué)試劑有限公司出品；其他試劑皆為分析純；試驗(yàn)用水為自制雙蒸水。

1.1.2 儀器 Dionex 500E型高效液相色譜儀為美國(guó)Dionex公司產(chǎn)品，色譜柱為科瑞Venus-C18-5u，檢測(cè)器為UVD170U紫外檢測(cè)器，分析軟件為Dionex chromeleox工作站；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)為江蘇鎮(zhèn)江市科密儀器儀表有限公司產(chǎn)品，KQ-600型超聲波清洗器為深圳市艾斯達(dá)工業(yè)自動(dòng)化有限公司產(chǎn)品，電子恒溫水浴鍋為上海普渡生化科技有限公司產(chǎn)品，旋渦混合器為合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 DNJ的測(cè)定方法 參照Kim等［12］的方法的基本原理，按照Yin等［13］描述的方法測(cè)定。

測(cè)試樣品的提?。悍Q取待測(cè)桑葉粉30mg，加入1mL 0.05mol·L-1HCl，渦流1min，超聲波處理40min，12 000r·min-1離心30min，收集上清液，沉淀物再按上步重復(fù)抽提1次，合并2次上清液，定容至2mL，即得樣品提取液。

DNJ的衍生化：取桑葉粉提取液140μL于1.5 mL的離心管，加入0.4mol·L-1硼酸鉀緩沖液（pH 值8.5）169μL，再加入5mmol·L-1的衍生化試劑FMOC-Cl（溶解于50%乙腈中）250μL，混勻，25℃恒溫水浴中反應(yīng)20min，加入1mol·L-1甘氨酸（Gly）25μL和剩余的FMOC-Cl以終止反應(yīng)，再加體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液66μL，用水定容至707μL，最后用孔徑0.2μm尼龍膜過(guò)濾，收集濾液，即得測(cè)試液。

測(cè)定方法：采用RP-HPLC法測(cè)定，色譜柱為科瑞Venus-C18-5u，檢測(cè)器為UVD170U紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，流動(dòng)相為乙腈∶0.1%醋酸（V∶V）＝11∶16，流速為1.0mL·min-1，進(jìn)樣量20μL。分析軟件為Dionex chromeleox工作站，外標(biāo)法分析計(jì)算。所有樣品均測(cè)定3次，平均值為其DNJ含量。

1.2 試驗(yàn)點(diǎn)基本概況 試驗(yàn)于2010年在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所瀠溪科研試驗(yàn)桑園進(jìn)行，該試驗(yàn)地土壤類型為紫色土。2月測(cè)定0～20cm的土壤肥力為：有機(jī)質(zhì)含量3.31%，全氮含量0.16%，有效磷含量11.76mg·kg-1，速效鉀含量164.16 mg·kg-1，土壤pH值為7.72。試驗(yàn)桑園栽植桑樹(shù)品種為川826，樹(shù)齡6年。桑樹(shù)栽植株行距0.66m×1.33m，種植密度為11 400株·hm-2，每個(gè)小區(qū)均設(shè)置隔離帶。1月上旬修枝整形，每株8根枝條，其他田間管理與常規(guī)管理相同。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用現(xiàn)代肥料二次回歸“3414”試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中對(duì)氮、磷、鉀3因素4水平14個(gè)處理（表1），隨機(jī)排列。設(shè)計(jì)中4個(gè)水平的含義：0水平為不施肥，2水平為當(dāng)?shù)赝扑]施肥量，1水平＝2水平×0.5，3水平＝2水平×1.5（該水平為過(guò)量施肥水平）。每種處理設(shè)3個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，小區(qū)面積為30m2。在有機(jī)肥6 000kg·hm-2的基礎(chǔ)上布置各施肥處理，肥料采用尿素（N 46%）、過(guò)磷酸鈣（P2O512%）、氯化鉀 （K2O 60%），在2月下旬施肥。

1.4 調(diào)查方法

1.4.1 肥料對(duì)桑樹(shù)不同部位葉DNJ含量的影響2 010年5月20日，查看并標(biāo)記正常發(fā)育、樹(shù)形較好的桑樹(shù)。每個(gè)小區(qū)選擇6棵桑樹(shù)，每棵桑樹(shù)選擇2條典型桑枝。6月10日在相同部位分別采摘2片嫩芽、嫩葉、成熟葉、老葉，每個(gè)處理的每個(gè)小區(qū)的各部位葉分別混合，60℃烘干后，研磨過(guò)200目篩，測(cè)定各處理桑樹(shù)不同部位葉的DNJ含量。

表1 “3414”施肥設(shè)計(jì)方案Tabe 1 Details of“3414”fertilizer experiment design

1.4.2 肥料對(duì)桑葉DNJ產(chǎn)量的影響 每個(gè)處理實(shí)收測(cè)產(chǎn)調(diào)查，收集每個(gè)處理所有的桑葉，60℃烘干后推算每公頃桑樹(shù)的干桑葉產(chǎn)量。將每個(gè)處理烘干的桑葉混合均勻，研磨過(guò)200目篩，測(cè)定每個(gè)處理桑葉的DNJ平均含量。

干桑葉產(chǎn)量（kg·hm-2）＝平均單株干桑葉質(zhì)量（kg·hm-2）×11 250（株·hm-2）；

桑葉DNJ產(chǎn)量（kg·hm-2）＝桑葉干物質(zhì)量（kg·hm-2）×桑葉DNJ的平均含量（%）。

1.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 13.0和SAS 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 施肥量對(duì)桑葉中DNJ含量的影響

2.1.1 施氮量對(duì)桑葉中DNJ含量的影響 選取P2K2相同水平不同 N 水平（N0＝0、N1＝120 kg·hm-2、N2＝240kg· hm-2、N3＝360 kg·hm-2），探討施氮量對(duì)桑葉中DNJ含量的影響（圖1）。結(jié)果表明，在同一處理中春季上位葉DNJ含量明顯高于下位葉：嫩芽＞嫩葉＞成熟葉＞老葉；桑葉中DNJ含量隨著施氮量的增加而顯著增高，在N2水平時(shí)，嫩芽、嫩葉、成熟葉和老葉DNJ含量達(dá)到最大，分別為0.398 8%、0.349 6%、0.246 2%和0.167 1%，隨著施氮量的進(jìn)一步增加，即N3水平，桑葉中DNJ含量顯著降低，但仍顯著高于N1水平。

圖1 施氮量對(duì)桑葉DNJ含量的影響Fig.1 Effects of nitrogen rate on the DNJ content of mulberry leaf

2.1.2 施磷量對(duì)桑葉DNJ含量的影響 選取N2K2相同水平不同P水平（P0＝0、P1＝42kg·hm-2、P2＝84kg·hm-2、P3＝126kg·hm-2），探討施磷量對(duì)桑葉中DNJ含量的影響（圖2）。結(jié)果表明，在同一處理中春季上位葉DNJ含量明顯高于下位葉：嫩芽＞嫩葉＞成熟葉＞老葉。嫩芽和嫩葉中DNJ含量變化趨勢(shì)相同，P2和P3、P0和P1相互之間桑葉中DNJ含量均沒(méi)有顯著差異，但前者DNJ含量顯著高于后者，嫩芽和嫩葉中DNJ最高含量分別為0.398 8%和0.349 6%。磷肥對(duì)春季成熟葉中DNJ含量影響較大，隨著施磷量的增加，成熟葉中DNJ含量也顯著增加，在P2水平時(shí)達(dá)到最大值，為0.246 2%，P3水平時(shí)又顯著降低，但仍顯著高于P1水平。隨著施磷量的增加，春季老葉中DNJ含量也顯著增加，在P2水平時(shí)達(dá)到最大值，0.167 1%，P3與P2之間沒(méi)有顯著差異。

2.1.3 施鉀量對(duì)桑葉中DNJ含量的影響 選取N2P2相同水平不同 K 水平 （K0＝0、K1＝60 kg·hm-2、K2＝ 120kg· hm-2、K3＝ 180 kg·hm-2），探討施鉀量對(duì)桑葉中DNJ含量的影響（圖3）。結(jié)果表明，在同一處理中，春季上位葉中DNJ含量大于下位葉：嫩芽＞嫩葉＞成熟葉＞老葉。嫩芽中DNJ含量在K0、K1和K3水平上均沒(méi)有顯著差異，但均顯著低于K2水平的嫩芽中DNJ含量（0.398 8%）；嫩葉、成熟葉和老葉中DNJ含量隨著施鉀量的增加表現(xiàn)相同的變化：K2和K3、K0和K1相互之間均沒(méi)有顯著變化，但前者顯著高于后者，DNJ含量最大值分別為0.349 6%、0.246 2%、0.167 1%。

2.2 桑葉平衡施肥設(shè)計(jì)肥料效應(yīng)模型的配置采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，利用當(dāng)年的肥料和DNJ價(jià)格［N（4.1元·kg-1）、P2O5（3.2元·kg-1）、K2O（5.0元·kg-1）、DNJ（2×108元·kg-1）］以及桑葉DNJ產(chǎn)量（表2），建立以桑葉總DNJ產(chǎn)量為函數(shù)及氮、磷、鉀為因子的肥料效應(yīng)函數(shù)，求算出最佳施肥量及最佳產(chǎn)量。

圖2 施磷量對(duì)桑葉DNJ含量的影響Fig.2 Effects of phosphorus rate on the DNJ content of mu1berry leaf

圖3 施鉀量對(duì)桑葉DNJ含量的影響Fig.3 Effects of potassium rate on the DNJ content of mu1berry leaf

表2 施肥水平對(duì)桑葉DNJ產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of fertilazation level on the DNJ content of mulberry

2.2.1 三元二次肥料效應(yīng)函數(shù) 桑葉三元二次肥料效應(yīng)函數(shù)：

由全因子模型求出最佳施肥量及最佳產(chǎn)量，即：桑葉中總DNJ最佳經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量為23.23kg·hm-2，推薦施肥指標(biāo)為N 286.11kg·hm-2、P2O 595.22 kg·hm-2、K2O 159.62kg·hm-2。

2.2.2 多種肥料效應(yīng)函數(shù)的施肥決策信息 四川大部分地區(qū)都存在過(guò)量施肥的情況。本試驗(yàn)對(duì)照地參照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施用量施肥，其中N 400kg·hm-2；P2O5200kg·hm-2，K2O 200kg·hm-2，其肥料總投入為3 280.00元·hm-2，DNJ產(chǎn)量為18.59 kg·hm-2；而推薦的施肥方案肥料總投入為2 275.85元·hm-2，肥料投入降低了30.61%，而其DNJ產(chǎn)量為23.23kg·hm-2，增加了24.96%。

3 討論

氮、磷、鉀是植物生長(zhǎng)的3種基本要素，但不同的植物對(duì)其需要量及其比例是不同的，不同肥力水平的土壤，施用肥料的最佳用量差別很大，尤其是藥用植物，對(duì)其精準(zhǔn)施肥的研究不僅要追求其含量和產(chǎn)量，還要注重次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。

張燕等［14］報(bào)道，單施氮肥對(duì)益母草（Leonurus artemisia）中水蘇堿和總生物堿產(chǎn)量有很大的促進(jìn)作用，足量的磷元素與氮元素合理配施可以提高氮的肥效。紀(jì)瑛等［15］研究表明，施用氮肥能顯著提高苦參（Sophoraflavescens）中總生物堿的含量和產(chǎn)量，但過(guò)量施用則呈降低趨勢(shì)。陳泉和李建國(guó)［16］報(bào)道，施肥并不能顯著影響植物生物堿的含量，只是顯著提高植物干物質(zhì)產(chǎn)量，從而增加了生物堿產(chǎn)量。其他相關(guān)研究［17-19］結(jié)果也證明，氮對(duì)植物體內(nèi)生物堿含量具有提高和促進(jìn)效應(yīng)。

肥料對(duì)桑葉中DNJ的含量和產(chǎn)量的影響的相關(guān)研究報(bào)道較少。Yin等［10］報(bào)道了不同氮素形態(tài)及其配比均能顯著影響桑葉中DNJ含量。而本研究結(jié)果表明，氮、磷、鉀單因素均能顯著影響春季桑葉中DNJ的含量，不同氮、磷、鉀施入量及其配比能顯著影響春季桑葉DNJ產(chǎn)量。氮素是DNJ合成的必需元素，所以施氮量對(duì)其含量和產(chǎn)量的影響較大，而磷、鉀元素可能直接或間接影響DNJ的合成［20］；過(guò)量施肥，桑葉DNJ含量不會(huì)提高，甚至?xí)@著降低，這可能是破壞了土壤環(huán)境的養(yǎng)分平衡或DNJ含量達(dá)到一定水平后表現(xiàn)的飽和反應(yīng)。

本研究利用肥料效應(yīng)函數(shù)得到桑葉DNJ的最佳產(chǎn)量及其最佳施肥指標(biāo)，為以桑葉為主要原料，并以DNJ為主要成分的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，提供獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)原料的施肥方法，為解決人工栽培中存在的藥材質(zhì)量不穩(wěn)定等問(wèn)題提供參考。

植物次生代謝產(chǎn)物的合成過(guò)程較為復(fù)雜，生物因素和非生物因素均能顯著影響其含量［21］，所以對(duì)其仍需系統(tǒng)的研究，尤其是影響DNJ生物合成的具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究探討。

4 結(jié)論

氮、磷、鉀的施肥水平能顯著影響桑葉中的DNJ含量。在單因素水平時(shí)，隨著施肥量的增加，桑葉中DNJ含量也隨之顯著增加，在N2P2K2水平時(shí)達(dá)到最大，再增施肥料，其含量基本沒(méi)有變化或者顯著降低，所以科學(xué)施肥能顯著提高桑葉的DNJ產(chǎn)量。通過(guò)建立肥料效應(yīng)函數(shù)，得到桑葉的推薦施肥指標(biāo)和DNJ最佳經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量：桑葉中總DNJ最佳經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量為23.23kg·hm-2，推薦施肥指標(biāo)為N 286.11kg·hm-2、P2O 595.22kg·hm-2、K2O 159.62kg·hm-2。

［1］Kimura T，Nakagawa K，Kubota H，etal.Food-grade mulberry powder enriched with 1-deoxynojirimycin suppresses the elevation of postprandial blood glucose in humans［J］.Journal Agricultural Food Chemist，2007，55（14）：5869-5874.

［2］Yatsunami K，Ichida M，Onodera S，etal.The relationship between 1-deoxynojirimycin content and alphaglucosidase inhibitory activity in leaves of 276mulberry cultivars（Morusspp.）in Kyoto［J］.Japanese Nature Medicine，2008，62（1）：63-66.

［3］耿鵬，朱元元，楊洋，等.桑樹(shù)資源中1-脫氧野尻霉素的測(cè)定及其生物活性分析［J］.中草藥，2005，36（8）：1151-1154.

［4］雷曉燕，黃海華.1-脫氧野尻霉素及其衍生物的藥理學(xué)與合成研究進(jìn)展［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，17（6）：456-460.

［5］關(guān)麗萍，鄭光浩，金晴昊，等.RP-HPLC測(cè)定不同地區(qū)、不同采集期桑葉中1-脫氧野尻霉素［J］.中草藥，2005，36（12）：1881-1882.

［6］李凡，裘雅漁，錢文春，等.桑葉中總生物堿和1-脫氧野尻霉素的含量考察［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2008，43（3）：176-179.

［7］歐陽(yáng)臻，陳鈞.不同季節(jié)桑葉中1-脫氧野尻霉素（DNJ）含量的測(cè)定［J］.食品科學(xué)，2004，25（10）：211.

［8］施新琴，崔為正，裘立群，等.用反相高效液相色譜—紫外檢測(cè)法測(cè)定1-脫氧野尻霉素的含量［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2006，32（1）：146-149.

［9］Meng X，Ouyang Z，Chang Y，etal.Contrast of 1-deoxynojirimycin content in mulberry leaves from different habitats［J］.Zhong Yao Cai，2008，31（1）：8-10.

［10］Yin H，Tong W H，Ye J J，etal.Effects of nitrogen amount and nitrogen form on 1-deoxynojimycin content in mulberry leaf［J］.Agricultural Science ＆ Technology，2010，11（6）：183-185.

［11］殷浩，佟萬(wàn)紅，葉晶晶，等.光照強(qiáng)度對(duì)桑葉中1-脫氧野尻霉素含量的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（28）：15634-15635，15654.

［12］Kim J W，Kim S U，Lee H S，etal.Determination of 1-deoxynojirimycin inMorusalbaL.leaves by derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate followed by reversed-phase high-performance liquid chromatography［J］.Journal Chromat Ography A，2003，1002：93-99.

［13］Yin H，Shi X Q，Sun B，etal.Accumulation of 1-deoxynojirimycin （1-DNJ）in silkworm，BombyxmoriL.［J］.Journal of Zhejiang Univercity-Science B，2010，11（4）：286-291.

［14］張燕，王文全，杜世雄，等.氮、磷、鉀對(duì)益母草生長(zhǎng)及水蘇堿和總生物堿影響的研究［J］.中草藥，2007，38（12）：1881-1884.

［15］紀(jì)瑛，張慶霞，藺海明，等.氮肥對(duì)苦參生長(zhǎng)和生物總堿的效應(yīng)［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2008，18（3）：159-164.

［16］陳泉，李建國(guó).栽培因子影響長(zhǎng)春花生物堿含量的研究進(jìn)展［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，29（4）：49-54.

［17］Sreevalli Y，Kulkarni R N，Baskaran K，etal.Increaseing the content of leaf and root alkaloids of high alkaloid con-tent mutants of periwinkle through nitrogen fertilization［J］.Industrial Crops and Products，2004，19：191-195.

［18］Afidi M M R K，Afaq Wasiuddiun S H，Khalique A，et al.Effect of different level of nitrogen on growth and alkaloid content ofDaturainnoxiaL［J］.Industrial Journal Pharmacology，1997，6：165-166.

［19］Demeyer K，Dejaegere R.Influence of the ion-balance in the growth medium on the yield and alkaloid con-tent ofDaturastramonium［J］.Plant Soil，1989，114：289-294.

［20］Pan R Z.Plant Physiology［M］.Beijing：Higher Education Publishing House，2004：107-108.

［21］沈曉霞，盛束軍，徐建中，等.環(huán)境因子對(duì)益母草總生物堿含量的影響［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2002，14（4）：221-225.