朱曉紅，沈佳鑫，馬 瑞，徐麗珊

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

抗氧化劑是食品、醫(yī)藥等行業(yè)不可缺少的添加劑，它能阻止或延遲食品氧化，以提高食品的穩(wěn)定性和保存期。目前，市場(chǎng)上的抗氧化劑主要分為天然抗氧化劑和化學(xué)合成抗氧化劑。由于化學(xué)合成抗氧化劑具有一定的毒性、致畸性和潛在的致癌性，使用過多會(huì)對(duì)人體健康造成重大危害。因此，尋找安全、高效的天然抗氧化劑成為近年來的一大研究熱點(diǎn)。天然抗氧化劑主要來源于植物，具有化學(xué)合成抗氧化劑所沒有的諸多優(yōu)點(diǎn)。

藍(lán)莓（blueberry）又稱越橘，屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium.spp）多年生落葉或常綠灌木。大量研究表明，藍(lán)莓果中含有豐富的抗氧化物質(zhì)，能延緩衰老[1]。但藍(lán)莓果產(chǎn)量較少，價(jià)格較昂貴，使藍(lán)莓果的試驗(yàn)研究受到了一定程度的限制。因而，一些研究者近年來開始對(duì)藍(lán)莓葉進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓葉中同樣含有豐富的抗氧化物質(zhì)[2]。而且在我國(guó)藍(lán)莓葉資源目前還沒有得到很好的利用。因此，開發(fā)藍(lán)莓葉中豐富的抗氧化物質(zhì)具有廣闊的前景。國(guó)內(nèi)外對(duì)藍(lán)莓葉的研究主要集中在抗氧化物質(zhì)的提取和純化方面，對(duì)于抗氧化物質(zhì)的體外抗氧化活性研究不多。

本試驗(yàn)通過設(shè)定一定的濃度梯度對(duì)藍(lán)莓葉水提物的體外抗氧化活性進(jìn)行研究，對(duì)研究藍(lán)莓葉中抗氧化物質(zhì)及開發(fā)新型天然抗氧化劑具有重要意義[3]。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

試劑：維生素C（上海青析化工科技有限公司）、BHA、藍(lán)莓葉、磷酸鹽緩沖液（pH 值為6.6）、六氰合鐵酸鉀溶液、三氯乙酸、三氯化鐵溶液、DPPH（上海如吉生物科技有限公司）、FeSO4、水楊酸、H2O2、總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

儀器：恒溫烘箱、電子天平、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、分光光度計(jì)、pH 計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓葉水提物提取 取一定量藍(lán)莓葉并剪碎，用料液比為1∶14 的藍(lán)莓葉與自來水混合，再用0.1 mol/L 的鹽酸調(diào)到pH 值為2.0，在100 ℃的沸水浴中提取60 min。將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，置于60 ℃烘箱中烘干，制成粉末備用[4]。

1.2.2 藍(lán)莓葉水提物含量測(cè)定 采用硫酸-香草醛法[5]和蘆丁法測(cè)定水提物中的原花青素和黃酮含量。

1.2.3 藍(lán)莓葉水提物還原力測(cè)定 取不同濃度藍(lán)莓葉水提物溶液2.5 mL 于試管中，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1%六氰合鐵酸鉀溶液。50 ℃水浴保溫20 min，快速冷卻，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，3 000 r/min 離心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.0 mL 蒸餾水、0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置10 min 后，在700 nm 處測(cè)定吸光度值[6]。

1.2.4 藍(lán)莓葉水提物對(duì)DPPH·自由基清除活性的測(cè)定 DPPH·自由基（1，1-二苯基苦基苯肼）是一種人工合成的穩(wěn)定自由基，其甲醇溶液顯紫色，在516 nm 處有最大吸收。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH·的單電子由于被配對(duì)，其濃度減小而顏色變淺，在波長(zhǎng)516 nm 處的吸光度值減小，對(duì)DPPH·自由基的淬滅能力可以有效地評(píng)價(jià)抗氧化劑的活性。DPPH·自由基清除活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[7-10]進(jìn)行。

DPPH·自由基的清除率計(jì)算公式為：GDPPH＝（1－（Ai－Aj）Ac）×100%。其中，GDPPH為清除率，Ai表示待測(cè)樣品液與DPPH 混合液在516 nm 處的吸光度值，Aj表示待測(cè)樣品液與無水乙醇混合液在516 nm 處的吸光度值，Ac表示無水乙醇與DPPH 混合液在516 nm 處的吸光度值。

1.2.5 藍(lán)莓葉水提物總抗氧化能力的測(cè)定 參照南京建成生物工程研究所生物總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)試盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓葉水提物含量測(cè)定

2.1.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線及其含量 采用硫酸-香草醛法，測(cè)得不同濃度的原花青素溶液在500 nm 處的吸光度值（圖1）。原花青素質(zhì)量濃度在0～0.1 mg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。其回歸方程為y＝1.305 8x，R2＝0.998 1，其中，y為試驗(yàn)所得的吸光度值（ABS），x 為樣品質(zhì)量濃度（mg/mL）。根據(jù)回歸方程，對(duì)藍(lán)莓葉水提物溶液進(jìn)行測(cè)定，通過計(jì)算得出藍(lán)莓葉水提物中原花青素含量為14.1%±0.9%。

2.1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及其含量 將蘆丁配制成不同濃度的溶液，并測(cè)定其在510 nm 處的吸光度值（圖2）。蘆丁質(zhì)量濃度在0～25 μg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。回歸方程為y＝0.030 4x＋0.000 4，R2＝0.999 6，其中，y 為試驗(yàn)所得的吸光度值（ABS），x 為樣品質(zhì)量濃度（μg/mL）。根據(jù)回歸方程，對(duì)藍(lán)莓葉水提物溶液進(jìn)行測(cè)定，通過計(jì)算得出藍(lán)莓葉水提物中黃酮含量為30.3%±0.1%。

2.2 藍(lán)莓葉水提物還原力測(cè)定

本試驗(yàn)將不同的抗氧化劑配制成同一濃度梯度的溶液，用還原力測(cè)定方法分別測(cè)定其在700 nm 處的吸光度值。吸光度值越大，表示還原力越強(qiáng)（圖3）。

通過圖3 及T 檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，在6～36 μg/mL范圍內(nèi)，BHA 和Vc 的還原力均高于藍(lán)莓葉水提物，且差異極顯著。不同抗氧化劑的還原力隨著濃度的增大而增強(qiáng)，且水提物隨著濃度的增大，還原力增強(qiáng)較緩；而Vc 和BHA 隨著濃度的增大，還原力增加較快。

將藍(lán)莓葉水提物分別與Vc，BHA 等質(zhì)量配制成12 μg/mL 的混合溶液，測(cè)定混合物的還原力（表1）。

表1 混合物還原力比較

表1 中的還原力數(shù)據(jù)經(jīng)T 檢驗(yàn)分析表明，（6 μg Vc＋6 μg 水提物）/mL 混合溶液的還原力均高于12 μg/mL Vc 的還原力和12 μg/mL 水提物的還原力，且差異極顯著。說明了Vc 和藍(lán)莓葉水提物之間存在協(xié)同作用。但BHA 與水提物按等質(zhì)量混合配成（6 μg BHA＋6 μg 水提物）/mL混合溶液時(shí)，其還原力小于12 μg/mL BHA 的還原力，但大于6 μg/mL BHA 的還原力，且差異均達(dá)極顯著水平。由此說明，我們可以通過增加水提物的量，減少BHA 的量來達(dá)到相同的還原效果。

2.3 藍(lán)莓葉水提物對(duì)DPPH·自由基的清除作用

試驗(yàn)測(cè)定了藍(lán)莓葉水提物、BHA 和Vc 在同一濃度梯度時(shí)，對(duì)DPPH·自由基的淬滅能力，其結(jié)果如圖4 所示。

經(jīng)過圖4 以及T 檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，在2.5～15.0 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，藍(lán)莓葉水提物對(duì)DPPH·自由基的清除能力均小于Vc 和BHA，且差異極顯著。藍(lán)莓葉水提物的清除率在10%～50%之間，清除率與水提物濃度之間近似正比例關(guān)系。但BHA 和Vc 在質(zhì)量濃度超過10 μg/mL時(shí)，它們的清除率增加不再明顯，基本穩(wěn)定在90%以上。

將Vc，BHA 和藍(lán)莓葉水提物按等質(zhì)量配制成5 μg/mL 的混合液，測(cè)定其對(duì)DPPH·自由基的清除率。表2 結(jié)果經(jīng)T 檢驗(yàn)分析表明，（2.5 μg BHA＋2.5 μg 水提物）/mL 混合溶液的DPPH·自由基清除率大于2.5 μg/mL BHA 對(duì)DPPH·自由基的清除率，小于5 μg/mL BHA 對(duì)DPPH·自由基的清除率，但差異都不顯著。這一結(jié)果說明，在食品中添加BHA 時(shí)可用一部分藍(lán)莓葉水提物來代替，以減少人工合成抗氧化劑給人們健康帶來的危害。

表2 混合物對(duì)DPPH·自由基清除率的比較

2.4 藍(lán)莓葉水提物總抗氧化能力的測(cè)定

總抗氧化體系是檢驗(yàn)抗氧化劑在食品體系中抗氧化作用的常用體系。本試驗(yàn)將抗氧化劑配制成溶液，測(cè)定水提物、Vc 和BHA 的總抗氧化能力，其結(jié)果如圖5 所示。

從圖5 可以看出，在總抗氧化能力上，當(dāng)質(zhì)量濃度為40 μg/mL 時(shí)，BHA 的總抗氧化能力大于水提物，且差異達(dá)極顯著水平；當(dāng)質(zhì)量濃度為80，200 μg/mL 時(shí)，BHA 的總抗氧化能力也大于水提物，且差異顯著；但當(dāng)質(zhì)量濃度為120，160，240 μg/mL 時(shí)，水提物與BHA 的總抗氧化能力相近，二者差異不顯著。而Vc 的總抗氧化能力很強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為40 μg/mL 時(shí)，其總抗氧化能力就超過水提物與BHA 最大濃度時(shí)的總抗氧化能力。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過對(duì)藍(lán)莓葉水提物的還原力、DPPH·自由基的清除能力和總抗氧化能力的測(cè)定，并以Vc 和BHA 為對(duì)照，來檢測(cè)水提物的抗氧化能力，同時(shí)考察了Vc 和BHA 對(duì)水提物抗氧化效果的影響。結(jié)果表明，藍(lán)莓葉水提物的還原力和DPPH·自由基的清除能力均低于Vc 和BHA，且差異達(dá)極顯著水平。但在還原力上，水提物與Vc 之間存在協(xié)同作用。因此，二者可同時(shí)使用。在DPPH·自由基清除能力上，可通過增加水提物的量，減少BHA 的量來達(dá)到相近的清除率。在總抗氧化能力上，雖然Vc 的活性很強(qiáng)，但BHA 和水提物差不多強(qiáng)弱，說明可以用藍(lán)莓葉水提物代替BHA，或者與BHA 混用，減少BHA的用量，減少其對(duì)人體健康的危害。因?yàn)樵谖覈?guó)藍(lán)莓葉資源豐富，提取工藝簡(jiǎn)便，藍(lán)莓葉水提物作為一種新型天然抗氧化劑應(yīng)用前景廣闊。

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