樊振華，王娟萍，孟 帆，吳 忻，劉文俊，米瑞娟，姚敬明，程海龍

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032；2.太谷縣畜牧中心，山西太谷030800）

豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）、豬細(xì)小病毒（PPV）是導(dǎo)致豬繁殖障礙病的主要病原體。其中，豬圓環(huán)病毒（PCV）是1974 年德國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)的新病毒[1]，1982 年命名為豬圓環(huán)病毒。PCV 有PCV1和PCV2 這2 種血清型。PCV2 具有較強(qiáng)的致病性，其經(jīng)鼻、口腔侵入不同日齡的豬體內(nèi)，在扁桃體局部淋巴結(jié)增殖后，向其他淋巴組織、肺、肝、腎傳播，懷孕母豬感染后，經(jīng)胎盤垂直感染給仔豬，初產(chǎn)母豬和新豬群產(chǎn)生繁殖障礙；PCV2 可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）以及增生性壞死性肺炎、皮炎和腎病綜合征、仔豬先天性震顫，該病多發(fā)生于5～12 周齡的仔豬。豬群患病率3%～50%，死亡率8%～35%，該病發(fā)展緩慢，豬群一次發(fā)病可持續(xù)12～18 個(gè)月。

豬細(xì)小病毒（PPV）于1967 年首次報(bào)道[1-2]。母豬初產(chǎn)或首次感染者會(huì)發(fā)生流產(chǎn)、死胎，仔豬大量死亡，育成豬發(fā)生皮炎、腹瀉、關(guān)節(jié)炎，豬場(chǎng)一旦感染，3 個(gè)月內(nèi)100%感染，會(huì)造成80%～100%死亡，感染豬很長(zhǎng)時(shí)間帶毒、排毒。這2 種疾病在臨床上呈現(xiàn)出相似的癥狀，又常常發(fā)生混合感染，使臨床診斷非常困難，必須依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行鑒別診斷[3]。

以往的血清學(xué)診斷準(zhǔn)確率低，病毒分離診斷方法雖然準(zhǔn)確，但操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。多重PCR 技術(shù)是在同一PCR 體系中加入多對(duì)引物，對(duì)多個(gè)目的基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增的分子生物學(xué)診斷方法，具有快速、敏感、特異、易于操作的優(yōu)點(diǎn)，可用一個(gè)樣品同時(shí)檢測(cè)多種病原體或多個(gè)基因型，達(dá)到對(duì)多種疾病的同步診斷，進(jìn)而縮短檢測(cè)時(shí)間，減少試劑消耗。王宏魁等[4]曾建立了檢測(cè)PCV2 和PCV1 的多重PCR 方法，周海范等[5]曾建立了檢測(cè)PRRSV，PCV2 的多重PCR 方法。

本試驗(yàn)利用多重PCR 技術(shù)對(duì)PPV 和PCV2進(jìn)行了檢測(cè)研究，建立同時(shí)快速鑒別診斷這2 種病毒的方法，并應(yīng)用于臨床實(shí)踐中，初步查明了山西這2 種豬病毒的感染情況。

1 材料和方法

1.1 病毒株、組織病料、陽(yáng)性對(duì)照

豬細(xì)小病毒株（PPV）、豬圓環(huán)病毒2 型毒株（PCV2）由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所提供，2 種病毒PCR 陽(yáng)性對(duì)照由北京世紀(jì)元亨動(dòng)物疫病防疫技術(shù)有限公司提供，臨床組織病料是山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究課題組從疑似病豬體內(nèi)采集。

1.2 主要試劑和引物

1.2.1 試劑 TaKaRa Ex Taq Taq DNA 聚合酶、DNA Marker DL 2 000 等試劑購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，病毒DNA 抽提試劑盒、PPV 和PCV2 病毒單項(xiàng)PCR 診斷試劑盒購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物疫病防疫技術(shù)有限公司。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 通過(guò)計(jì)算機(jī)網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找出PPV，PCV2 的基因序列，利用Primer Premier 5.0 軟件按照引物設(shè)計(jì)原則，最后選擇PPV 的VP2 基因、PCV2 的ORF2 基因?yàn)槠鋽U(kuò)增靶序列[6]，借助計(jì)算機(jī)篩選設(shè)計(jì)出符合多重PCR 要求的2 對(duì)引物，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成（表1）。

表1 多重PCR 引物

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病毒模板DNA 的提取

1.3.1.1 病料采集與處理 取病、死豬有明顯病變與健康部交界處的淋巴結(jié)、扁桃體、脾臟、肺、肝、腎等組織，－70 ℃保存。

1.3.1.2 病毒模板DNA 的提?。ò纯侱NA 抽提試劑盒操作步驟進(jìn)行） （1）稱取待檢病料0.1 g置組織研磨器中剪碎并研磨，加入1.5 mL PBS（pH 值7.2）繼續(xù)研磨成勻漿后，8 000 r/min 離心5 min，取其上清液100 μL，加入500 μL 消化液、10 μL 蛋白酶K 混勻，置55 ℃水浴中過(guò)夜。病毒細(xì)胞液、血清、陽(yáng)性對(duì)照液、陰性對(duì)照液（滅菌去離子水）可直接取100 μL，加入500 μL 消化液、10 μL 蛋白酶K 混勻，置于室溫下10 min。（2）從水浴鍋中取出樣品，加入酚300 μL（用前不要晃動(dòng)，不要吸到上層保護(hù)液）、氯仿/異戊醇混合液（24/1）300 μL，顛倒10 次，12 000 r/min 離心10 min。（3）取500 μL 上清液置于滅菌離心管中，加入500 μL 異丙醇混勻，置液氮中3 min 或-70 ℃冰箱中30 min。取出樣品管，室溫下融化，13 000 r/min 離心15 min。（4）棄上清，倒扣在衛(wèi)生紙上吸干（1 min），沿管壁緩緩加入1 mL 75%乙醇（凍存），13 000 r/min 離心15 min。（5）棄上清，倒扣在吸水紙上吸干（1 min），再將離心管開口置50 ℃恒溫金屬浴中15 min 或真空抽干15 min（以無(wú)乙醇為準(zhǔn)）。（6）取出樣品管，用30 μL 滅菌去離子水溶解沉淀，模板-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 單相PCR 檢測(cè)方法的建立 分析測(cè)定PCR 反應(yīng)最適條件，包括退火溫度、引物濃度、MgCl2濃度等因素[7]，首先確定每種病毒單相PCR反應(yīng)最佳條件。

1.3.3 多重PCR 檢測(cè)方法的建立 在單相PCR的基礎(chǔ)上，進(jìn)行多重PCR 試驗(yàn)，其反應(yīng)總體積、各引物和試劑的劑量不變，各模板比例按等劑量加入，減少滅菌雙蒸水的用量，擴(kuò)增條件統(tǒng)一以退火溫度較低的循環(huán)參數(shù)為準(zhǔn)，試驗(yàn)結(jié)果較好[8]。

1.3.4 PCR 檢測(cè)敏感性試驗(yàn) 將提取的2 種病毒DNA 模板，用Gene Quant Ⅱ核酸定量?jī)x測(cè)定其含量，然后將2 種病毒模板分別進(jìn)行10 倍系列稀釋，各取1 μL，按照優(yōu)化的PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行PCR 檢測(cè)，以其模板最高稀釋倍數(shù)擴(kuò)增呈陽(yáng)性為其PCR 的敏感度。

1.3.5 PCR 特異性試驗(yàn) 將病料作DNA 提取后，用多重PCR 檢測(cè)方法，擴(kuò)增體系中加入2 種被檢測(cè)病毒的引物與DNA 模板，同時(shí)設(shè)豬瘟病毒（CSFV）、豬流感病毒（SIV）及陰性對(duì)照，按以上條件進(jìn)行相同的PCR 擴(kuò)增。

1.3.6 PCR 產(chǎn)物檢測(cè) 采用1.5 g/L 瓊脂糖凝膠，PCR 產(chǎn)物15 μL，與上樣緩沖液3 μL 混合加樣，用TAE 電泳緩沖液，電壓5 V/cm，單相PCR電泳30 min；多重PCR 電泳40 min，紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照、記錄。

1.3.7 自然感染病料的檢測(cè) 用建立的多重PCR 方法，與北京世紀(jì)元亨動(dòng)物疫病防疫技術(shù)有限公司提供的2 種病毒PCR 檢測(cè)試劑盒，對(duì)采集的82 份病料進(jìn)行2 種病毒的單相PCR 檢測(cè)與多重PCR 檢測(cè)對(duì)比試驗(yàn)，以多重PCR 檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)與單相PCR 檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)之比為其二者的陽(yáng)性符合率。

1.3.8 臨床樣品檢測(cè)應(yīng)用試驗(yàn) 從10 個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)和門診病例的病豬無(wú)菌采血樣，分離血清于1.5 mL 離心管中－70 ℃保存?zhèn)溆谩Ｆ蕶z病死豬取有明顯病變與健康部交界處的淋巴結(jié)、扁桃體、脾臟、肺、肝、腎等組織，-70 ℃保存。共收集血樣和病料211 份。

2 結(jié)果與分析

2.1 單相PCR 檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果

按照2 種病毒單相PCR 優(yōu)化后的反應(yīng)條件，分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如圖1、圖2 所示。

2.2 多重PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

多重PCR 反應(yīng)條件為總體積20 μL：MgCl2（150 μmol/L）2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，10×PCR Buffer 2 μL，2 種病毒的上下游引物混合液各2 μL（每條引物濃度10 pmol/mL），2 種病毒模板各2 μL，Taq 酶（0.5 U/μL）2 μL，滅菌雙蒸水4 μL。

多重PCR 的擴(kuò)增條件：94 ℃3 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，循環(huán)35 次；72 ℃延伸7 min。

2.3 PCR 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)定出所用模板的DNA 含量是：PPV 為16 ng/μL，PCV2 為19 ng/μL；10 倍稀釋2 種病毒模板后，分別進(jìn)行100～10-5的單相PCR 與多重PCR 擴(kuò)增，結(jié)果如表2 和圖3 所示。

表2 PCR 敏感性結(jié)果

由表2 可知，多重PCR 比單項(xiàng)PCR 病毒的最低核酸檢測(cè)量降低了約100.5～102個(gè)數(shù)量級(jí)，但仍然具有很強(qiáng)的敏感性，達(dá)到了pg（微微克，10-12g）級(jí)別，表明建立的多重PCR 反應(yīng)具有很高的敏感性。

2.4 多重PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過(guò)一次擴(kuò)增，可檢測(cè)出多重PCR 相應(yīng)病毒的特異條帶，目的基因全部擴(kuò)出，CSFV，SIV，陰性對(duì)照全部為陰性，而且無(wú)交叉反應(yīng)。多重PCR重復(fù)性及特異性與單相PCR 結(jié)果完全一致。

2.5 多重PCR 對(duì)自然感染病料的檢測(cè)結(jié)果

單相PCR 與多重PCR 的陽(yáng)性符合率平均為100%，建立的多重PCR 檢測(cè)方法具有良好的特異性和重復(fù)性，診斷條帶清晰、無(wú)交叉反應(yīng)，在臨床診斷中準(zhǔn)確率可達(dá)98%以上，可用于臨床診斷。

PPV＋PCV2 mPCR 擴(kuò)增結(jié)果如圖4 所示。

2.6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

211 份樣品中檢出豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）陽(yáng)性56 份，陽(yáng)性率為27%；豬細(xì)小病毒病（PPV）陽(yáng)性42 份，陽(yáng)性率為20%；二者混合感染17 份，陽(yáng)性率為8%（圖5 和表3）。

表3 多重PCR 檢測(cè)PPV，PCV2 病原結(jié)果

3 結(jié)論與討論

（1）在建立多重PCR 體系中，引物的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵，經(jīng)分析PPV，PCV2 基因組信息后，在單相PCR 引物的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出了適于多重PCR 的2 對(duì)引物。利用2 對(duì)特異性引物，在一次PCR 中擴(kuò)增出豬細(xì)小病毒（313 bp）、豬圓環(huán)病毒2 型（447 bp）的特異性片斷，成功地建立了PPV，PCV2 的多重PCR 檢測(cè)方法，試驗(yàn)證實(shí)了該方法特異性強(qiáng)、敏感性高和重復(fù)性好，可節(jié)省40%的檢測(cè)成本和時(shí)間，適用于臨床鑒定豬細(xì)小病毒和圓環(huán)病毒2 型，為鑒定這2 種豬病毒提供了一種準(zhǔn)確、快速的技術(shù)手段。

（2）應(yīng)用山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究課題組建立的多重PCR 檢測(cè)技術(shù)，在211 份樣品中檢測(cè)出豬圓環(huán)病毒2 型陽(yáng)性56 份，感染率為27%；豬細(xì)小病毒陽(yáng)性42 份，感染率為20%；二者混合感染陽(yáng)性17 份，混合感染率為8%。證明山西豬群已比較嚴(yán)重地感染了這2 種疫病，今后應(yīng)加強(qiáng)防疫免疫等綜合措施。

（3）在我國(guó)，PCV2 和PPV 造成的豬繁殖障礙最為普遍和嚴(yán)重，特別是這2 種病原?；旌细腥?；病毒既可水平傳播，又可垂直傳播；可以引起70%以上的初產(chǎn)母豬發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱仔，仔豬死亡，免疫抑制等危害，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失?，F(xiàn)在豬細(xì)小病毒和圓環(huán)病毒2 型疫苗已經(jīng)在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，通過(guò)大家不懈的努力，一定能夠有效地控制這2 種病毒的流行。

［1］Barbara E Straw，Syilvie D’Allaire.豬病學(xué)[M].趙德明，張仲秋，沈建忠，譯.8 版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003.

［2］殷震.動(dòng)物病毒學(xué)[M].北京：科技出版社，1985：810-814.

［3］王澤洲，于勇，吳越，等.豬生殖障礙疾病的研究概況[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，2007，37（9）：823-826.

［4］王宏魁，彭志鋒，孫彥婷，等.豬圓環(huán)病毒復(fù)合PCR 檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（1）：109-111.

［5］周海范.豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病復(fù)合PCR 診斷方法的建立及應(yīng)用[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（1）：106-109.

［6］孫明，李衛(wèi)紅，高顯明，等.應(yīng)用多聯(lián)PCR 對(duì)引發(fā)豬繁殖障礙有關(guān)病毒的檢測(cè)1.JEV，PPV，PRRSV，PRV 多聯(lián)PCR 引物設(shè)計(jì)[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，20（1）：10-14.

［7］Joseph Sambrook，David W Russell.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].黃培堂，譯.3 版.北京：科學(xué)出版社，2005：698-699.

［8］趙麗，崔寶安.豬偽狂犬病病毒及豬細(xì)小病毒復(fù)合PCR 檢測(cè)方法的建立[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，24（2）：206-209.