王中華

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑部，天津 300193)

制劑與質(zhì)量控制

當(dāng)歸中阿魏酸含量測定及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

王中華

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑部，天津 300193)

目的 參照高效液相色譜法(《中華人民共和國藥典2010年版》一部附錄ⅥD)試驗(yàn)，對當(dāng)歸中的主要成分阿魏酸進(jìn)行含量測定。方法 根據(jù)不同的流動相、提取方法、提取時間、取樣量、提取溶劑、濃縮溫度，最終確定最佳的測定方法，即以乙腈—0.1%磷酸(22∶78)為流動相;檢測波長為324 nm，取樣量為4 g，70%甲醇回流提取30 min，80℃的水浴加熱的濃縮溫度。結(jié)果 根據(jù)實(shí)驗(yàn)并通過線性關(guān)系考察，證明線性關(guān)系良好。重復(fù)性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、回收率均符合要求。結(jié)論 此方法當(dāng)歸以阿魏酸(C10H10O4)計(jì)，不少于0.10 mg，可作為以當(dāng)歸為主要成分的中藥制劑的質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)和參考依據(jù)。

阿魏酸;當(dāng)歸;分析;色譜法，高壓液相

當(dāng)歸是常用中藥材之一，也是許多中成藥組方中的常用品種，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便等功效。其主要成分有揮發(fā)油類、香豆素類、有機(jī)酸類、糖類、黃酮類、氨基酸、維生素和其他微量元素具有很高的藥用價值。其中有機(jī)酸類中主要成分阿魏酸，具有抗氧化和清除自由基的作用，能有效抑制血小板聚集和血栓形成，可用于治療多種心腦血管性疾病。我們利用高效液相色譜(HPLC)法測定當(dāng)歸的主要有效成分阿魏酸的含量，能較好地反映其相關(guān)成品的質(zhì)量和療效［1］，可作為以當(dāng)歸為主要成分的中藥制劑的質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)。故參照《中華人民共和國藥典2010年版》一部項(xiàng)下相關(guān)方法，制訂了其HPLC法的含量測定標(biāo)準(zhǔn)和方法［2］。

1 HPLC法測定當(dāng)歸中阿魏酸

1.1 儀器與試藥 儀器:LC－10ATVP島津高效液相色譜儀;SPD—10A VP N2000數(shù)據(jù)工作站(浙江大學(xué)智能信息研究所);HP1100 DAD檢測器;FA1104電子分析天平(上海精科天平廠);DK98－1型電熱恒溫水浴鍋(雙列六孔，天津中環(huán)科技開發(fā)公司);ACO－3120型真空泵(上海會行農(nóng)機(jī)廠);超聲處理器(北京醫(yī)療設(shè)備二廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器公司);藥典篩(浙江五星沖壓篩具廠);101 2BS電熱恒溫干燥箱(天津中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司);ZDHW調(diào)溫型電熱套(5 000 mL，河北省黃驊中興儀器有限公司);DL－1單聯(lián)電爐(2 000 W，北京中興偉業(yè)儀器有限公司);玻璃儀器等。色譜柱:Irregular－H C18，10 μm，250 mm ×4.6 mm。試劑:乙腈、磷酸，為色譜純，其余甲醇等試劑均為分析純;水為蒸餾水(自制)。對照品:阿魏酸(中國藥品生物制品檢定所，批號:110773－200911)。樣品:黃地散(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，主要成分:當(dāng)歸、生地黃、何首烏、黃精等，批號:090426，090428，090429)。

1.2 方法學(xué)的考察

1.2.1 測定波長的選擇與考察 《中華人民共和國藥典2010年版》一部［2］當(dāng)歸項(xiàng)下，檢測波長為316 nm，用島津高效液相色譜儀，在波長200～600 nm進(jìn)行掃描，阿魏酸在324 nm處有最大吸收峰，最終確定324 nm為檢測波長。見圖1。

圖1 阿魏酸HPLC掃描圖(200～600 nm)

1.2.2 流動相的選擇與考察 本實(shí)驗(yàn)采用4個不同系統(tǒng)的流動相:乙腈－0.1%磷酸、乙腈－1%冰乙酸、甲醇－0.1%磷酸、甲醇－1%冰乙酸進(jìn)行測定，同時考察了各系統(tǒng)不同組成比例的流動相測定［3］。

結(jié)果:流動相乙腈－0.1%磷酸(22∶78)阿魏酸出峰時間適中，約為14 min，分離度好，確定為最終的流動相。柱溫:室溫;流速:0.8 mL/min;理論板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算不低于3 000。

1.2.3 取樣量的選擇與考察 取同一批號(090426)樣品，共 4 份，分別精密稱定 2、4、6、8 g，置具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。在流動相乙腈－0.1%磷酸(22∶78)色譜條件下測定樣品中阿魏酸峰面積。結(jié)果見圖2～5和表1。

圖2 樣品(2 g)的阿魏酸HPLC圖

圖3 樣品(4 g)的阿魏酸HPLC圖

圖4 樣品(6 g)的阿魏酸HPLC圖

圖5 樣品(8 g)的阿魏酸HPLC圖

表1 樣品不同取樣量的阿魏酸含量測定結(jié)果 (n=2)

結(jié)果顯示，取樣量以2、4 g阿魏酸含量接近，但是2 g取樣量所測得峰面積過小，不利于實(shí)驗(yàn)操作，故選擇取樣量為4 g。

1.2.4 提取方法的選擇與考察 取同一批號(090426)樣品，共2份，各4 g，分別精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，其中1份加熱回流30 min，另1份超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。在流動相乙腈－0.1%磷酸(22∶78)色譜條件下測定樣品中阿魏酸峰面積，結(jié)果見圖6、7和表2。

圖6 超聲提取的阿魏酸HPLC圖

圖7 回流提取的阿魏酸HPLC圖

結(jié)果顯示，回流提取測得樣品的阿魏酸含量高于超聲處理的樣品，故確定回流的提取方法。

表2 不同提取方法的阿魏酸測定結(jié)果 (n=2)

1.2.5 提取溶劑的選擇與考察 取同一批號(090426)樣品，共2份，各4 g，分別精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加70%甲醇、100%甲醇各50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，分別各自用70%甲醇、100%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。在流動相乙腈－0.1%磷酸(22∶78)色譜條件下測定樣品中阿魏酸峰面積，結(jié)果見圖8、9和表3。

圖8 100%甲醇提取的阿魏酸HPLC圖

圖9 70%甲醇提取的阿魏酸HPLC圖

表3 不同溶劑提取的阿魏酸測定結(jié)果 (n=2)

結(jié)果顯示，70%甲醇提取測得的阿魏酸含量高于100%甲醇提取的處理的樣品，故確定70%甲醇為提取溶劑。

1.2.6 提取時間的選擇與考察 取同一批號(090426)樣品，共3份，各4 g，分別精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，分別加熱回流15、30、45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。在流動相乙腈 －0.1%磷酸(22∶78)色譜條件下測定樣品中阿魏酸峰面積。結(jié)果見圖10～12和表4。

圖10 70%甲醇(15 min)提取的阿魏酸HPLC圖

圖11 70%甲醇(30 min)提取的阿魏酸HPLC圖

圖12 70%甲醇(45 min)提取的阿魏酸HPLC圖

表4 不同回流提取時間的阿魏酸測定結(jié)果 (n=2)

結(jié)果顯示，以回流提取30 min時，測定的阿魏酸含量為最高。

1.2.7 濃縮溫度的選擇與考察 為提高樣品溶液的濃度，減少阿魏酸的加熱損失，便于測定，考慮將樣品溶液進(jìn)行濃縮，本實(shí)驗(yàn)考察了60、80℃下的影響。取同一批號(090426)樣品，共2份，各4 g，分別精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液25 mL，分別置60、80℃的水浴上濃縮至近干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。在流動相乙腈－0.1%磷酸(22∶78)色譜條件下測定樣品中阿魏酸峰面積，結(jié)果見圖13、14和表5。

圖13 70%甲醇(60℃)提取的阿魏酸HPLC圖

圖14 70%甲醇(80℃)提取的阿魏酸HPLC圖

表5 不同濃縮溫度的阿魏酸測定結(jié)果

結(jié)果顯示，雖然80℃的水浴加熱濃縮溫度高于60℃，容易造成阿魏酸的加熱損失，但濃縮時間大大縮短，對阿魏酸的含量影響也不大，故選定80℃的水浴加熱為濃縮的溫度。

1.3 溶液的制備

1.3.1 對照品溶液的制備 取阿魏酸對照品適量，精密稱定，加70%甲醇溶液制成每mL含8 μg的溶液，即得。

1.3.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的樣品，研細(xì)，取約4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，置80℃水浴蒸至近干，殘?jiān)?0%甲醇適量溶解，移至5 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖15 阿魏酸對照品HPLC圖

1.3.3 陰性對照液的制備 取缺少當(dāng)歸的處方藥，按制備工藝制得樣品，再按供試品溶液的制備方法，制得陰性樣品溶液。進(jìn)樣后HPLC圖中與阿魏酸相應(yīng)位置上無吸收。見圖15～17。

圖16 阿魏酸供試品HPLC圖

圖17 阿魏酸陰性對照品HPLC圖

1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(090426)樣品，取1份，研細(xì)，取4 g，按照“1.3.2”供試品溶液制備操作，按流動相乙腈－0.1%磷酸(22∶78)色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定樣品中阿魏酸峰面積，測得峰面積值的RSD為1.11%，符合要求，結(jié)果見表6。

表6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(090426)樣品，共6份，研細(xì)，取4 g，按照“1.3.2”供試品溶液制備操作，按流動相乙腈－0.1%磷酸(22∶78)色譜條件分析，測定每份樣品中阿魏酸含量。結(jié)果樣品中阿魏酸平均含量為0.023 21 mg/g，RSD為1.32%，符合要求，結(jié)果見表7。

表7 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(090426)樣品，取1份，研細(xì)，取4 g，按照“1.3.2”供試品溶液制備操作，按流動相乙腈 －0.1%磷酸(22∶78)色譜條件分析，分別在 0、1、2、4、8、24 h，測定樣品中阿魏酸峰面積，測得峰面積值的RSD為2.06%，符合要求，結(jié)果見表8。

表8 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

1.7 線性關(guān)系的考察 對照品溶液的制備:取阿魏酸對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每mL含0.208 mg的溶液置作為儲備液，再分別精密量取 0.2、1、2、4、6、8 mL，置25 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，分別精密吸取上述6種濃度的對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按流動相乙腈－0.1%磷酸(22∶78)色譜條件分析，測定各自峰面積，以峰面積為橫坐標(biāo)，阿魏酸對照品的含量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程為:Y=3.09E －005X，r=1.000 0，表明阿魏酸在 0.016 64 ～0.665 6 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，見表9、圖18。

表9 線性關(guān)系考察測定結(jié)果

圖18 阿魏酸對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批號(090426)樣品，共6份，研細(xì)，取2 g，精密稱定，分別加入阿魏酸對照品溶液0.049 92 mg/mL各 1 mL，精密加入 70% 甲醇 49 mL，再按照“1.3.2”供試品溶液制備操作，制得供回收率用供試品溶液，按流動相乙腈－0.1%磷酸(22∶78)色譜條件分析，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為 101.76%，RSD為1.28%。結(jié)果見表10。

表10 加樣回收率試驗(yàn)測定結(jié)果

2 樣品中阿魏酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的測定

樣品的制備:取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，置80℃水浴蒸至近干，殘?jiān)?0%甲醇適量溶解，移至5 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。測定3批樣品中阿魏酸含量。見表11。

由于當(dāng)歸中阿魏酸含量較低為0.05%，通過測定3批中試成品的含量，同時考慮使用藥材的質(zhì)量差異，按其轉(zhuǎn)移率40%，作為含量限度。轉(zhuǎn)移率是根據(jù)當(dāng)歸的投料量以及《中華人民共和國藥典2010年版》中所規(guī)定的當(dāng)歸中阿魏酸的含量要求，算出總的阿魏酸含量，乘以40%，得出成品中要求的阿魏酸的最低含量，即每袋含阿魏酸不低于0.10 mg。

表11 樣品含量測定結(jié)果 (n=2)

3 結(jié)論

以當(dāng)歸中的阿魏酸為含量指標(biāo)，應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，優(yōu)選了最佳提取制備工藝，即煎煮3次，每次1.5 h，加10倍量水。結(jié)果表明制備工藝方法簡單可靠，具有科學(xué)性和可行性。

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):照高效液相色譜法(《中華人民共和國藥典2010年版》一部附錄VI D)［2］試驗(yàn)，對當(dāng)歸中的主要成分阿魏酸進(jìn)行含量測定，根據(jù)不同的流動相、提取方法、提取時間、取樣量、提取溶劑及濃縮溫度，最終確定最佳的測定方案，即以乙腈－0.1%磷酸(22∶78)為流動相;檢測波長為324 nm，理論板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。取樣量為4 g，70%甲醇回流提取30 min，80℃的水浴加熱的濃縮溫度。并通過線性關(guān)系考察，證明線性關(guān)系良好。重復(fù)性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、回收率均符合要求。8 g/袋包裝中，當(dāng)歸以阿魏酸(C10H10O4)計(jì)，不少于0.10 mg?？勺鳛橐援?dāng)歸為主要成分的中藥制劑的質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)和參考依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)提取工藝的確定應(yīng)以制劑的安全、有效、穩(wěn)定為最終目標(biāo)。當(dāng)歸中阿魏酸在提取時會因受熱而出現(xiàn)不穩(wěn)定(損失)的現(xiàn)象，故應(yīng)嚴(yán)格控制提取時的受熱時間和溫度。

本實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要是檢測阿魏酸的含量，由于其受熱后不穩(wěn)定，而且轉(zhuǎn)移率較低，對生產(chǎn)和鑒別會產(chǎn)生影響，未來還應(yīng)設(shè)法提高阿魏酸的轉(zhuǎn)移率和最低含量。

在方法學(xué)考察中發(fā)現(xiàn)，相關(guān)項(xiàng)目的色譜圖的對比差別性不高。目標(biāo)峰的峰面積較小，未來還應(yīng)考慮對各項(xiàng)色譜條件進(jìn)一步優(yōu)化和提高。

［1］ 王寶琴.中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)準(zhǔn)物研究［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1994:309，615.

［2］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版:一部［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:488－489.

［3］ 唐力英，王祝舉，赫炎，等.高效液相色譜法測定當(dāng)歸中阿魏酸的含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2006，12(2):14 －15.

Determination of ferulic acid in Angelica and research of quality standards

WANG Zhonghua.Department of Pharmacy，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193

Objective To refer to high－performance liquid chromatography(《Chinese Pharmacopoeia》2010 of one appendix Ⅵ D)trial and determine the ferulic acid in the main components of Chinese angelica.Methods With different the mobile phase，extraction method，extraction time，sample volume，extraction solvent，concentration temperature，ultimately the best method for the determination was determined that Acetonitrile － 0.1%phosphoric acid(22 ∶78)as mobile phase;detection wavelength is 324 nm，sample volume is 4 g，70%methanol extraction and 30 min，the temperature of concentrating is 80 ℃ water bath heating.Results Through investigation proves the method of the linear relations is best.Repeatability，reproducibility，stability，recovery rates are to meet requirements.Conclusion Angelica calculated in accordance with ferulic acid(C10H10O4)is not less than 0.10 mg/8 g and this method can be as quality inspection standards and reference of a main component for angelica of traditional Chinese medicine preparation.

Ferulic acid;Angelica;Content determination;High－performance liquid chromatography

R282.71;R284.1;R932.41

A

1002－2619(2012)07－1058－06

王中華(1970—)，男，主管藥師，碩士。研究方向:中藥制劑和化學(xué)分析。

2010－01－30)