張曉飛 魏亞強

1.陜西省延安市人民醫(yī)院腫瘤科，陜西延安 716000；2.陜西省延安市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西延安 716000

1999年，Kojima等[1]發(fā)現(xiàn)生長激素釋放肽（Ghrelin）是促生長激素分泌物受體（GHS-R）的第一個內(nèi)源性配體，由28個氨基酸殘基構(gòu)成的一種小分子多肽。Ghrelin主要的產(chǎn)生部位是胃黏膜，但是在多種組織中也有表達，如腸道、胰腺、下丘腦、垂體、腎、胎盤等[2-4]，Ghrelin作為一種腦腸肽表現(xiàn)出了不同的生理調(diào)節(jié)功能。本次研究選擇2007年9月～2009年12月我院收治的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者標(biāo)本72例，所有患者均施行根治性手術(shù)治療，通過觀察Ghrelin在NSCLC組織中的表達，探討其臨床意義，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為2007年9月～2009年12月在我院施行根治性手術(shù)治療的NSCLC患者72例，設(shè)置肺正常組織作為對照，選擇同期手術(shù)正常標(biāo)本30例，經(jīng)過病理HE染色確診全部病例符合研究標(biāo)準(zhǔn)。72例患者中，男41例，女31例；年齡36～75歲，平均（64.5±2.5）歲；所有患者均未在術(shù)前接受任何的化療放療?；颊咴邝[癌、腺癌、高分化癌、中分化癌和低分化癌分別有42、30、28、22、22例。TNM分期（2009年肺癌國際分期修訂版）中，Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期27例，發(fā)生與未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的各為32例和40例。

1.2 方法

1.2.1 試劑 純化兔抗人Ghrelin抗體（一抗）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）。二抗和三抗的S-P試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)），包括內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑（3%雙氧水），正常山羊血清工作液，二抗（生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG）工作液，三抗（辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素）工作液，DAB（3，3-二氨基聯(lián)苯胺）試劑盒。

1.2.2 標(biāo)本處理及組織切片 所有組織標(biāo)本都采用10%中性甲醛溶液進行固定，常規(guī)進行脫水，石蠟包埋處理，切片厚度5μm，膠片撈片均涂有氨丙基-三乙氧基硅烷。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測 免疫組化SP法，在60℃烤箱中放置染色石蠟切片，烤40 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化。用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，然后滴加3%雙氧水封閉，室溫下進行10 min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶。用PBS沖洗5 min，沖洗3次；然后山羊血清封閉，室溫下進行15 min；然后，滴加50μL一抗溶液，在4℃溫度下過夜。第2天，采用PBS沖洗5 min，沖洗3次，然后滴加二抗溶液，在37℃的溫度孵育30 min；然后用PBS沖洗5 min，沖洗3次，然后滴加三抗溶液，在37℃的溫度下孵育30 min；3，3-二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。光鏡觀察，空白陰性對照組每次染色的時候都以0.01 mmol/L PBS代替一抗溶液。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

應(yīng)用雙人雙盲法進行全面的觀察與判斷，主要判斷標(biāo)準(zhǔn)有：①陽性細(xì)胞：腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒并且染色強度顯著高于非特異性背景著染。②顯微鏡下每例隨機選擇10個高倍視野（×400），然后計算出陽性細(xì)胞的百分比。根據(jù)陽性細(xì)胞的百分比分為2級：陰性：無陽性細(xì)胞或≤10%，陽性：＞10%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

本次研究所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件給予處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ghrelin在肺正常組織與肺癌組織中的表達

肺正常組織與肺癌組織的Ghrelin的表達中，陽性率分別為13.33%和58.33%，前者明顯低于后者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。Ghrelin陽性信號位于肺癌細(xì)胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒。肺癌組織中Ghrelin的表達見圖1。

表1 肺癌組織與肺正常組織中Ghrelin的表達（例）

圖1 不同肺癌組織中Ghrelin的表達情況（免疫組化SP法）

2.2 Ghrelin在肺癌組織的表達及臨床意義

Ghrelin在肺癌組織中表達與臨床病理參數(shù)之間不存在統(tǒng)計學(xué)差異的包括性別、吸煙與否、分化程度、病理分型，即P＞0.05；Ghrelin在肺癌組織中表達與臨床病理參數(shù)之間存在統(tǒng)計學(xué)差異的為臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否，即P＜0.05。見表2。

表2 肺癌組織中Ghrelin的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（例）

3 討論

Ghrelin是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一一種GHS-R的內(nèi)源性配體，Kojima等[1]于1999年就已經(jīng)開展研究并通過采用免疫組化的方法從小鼠和人的胃內(nèi)分泌細(xì)胞及下丘腦弓狀核中將Ghrelin分離出來，名稱的來源是因為具有促進生長激素釋放的作用。Ghrelin是一種由28個氨基酸組成的3位絲氨酸?；男》肿佣嚯?，Ghrelin主要的產(chǎn)生部位是胃黏膜，但是在多種組織中也有表達，比如腸道、胰腺、下丘腦、垂體、腎、胎盤等[2-4]；Ghrelin的受體在很多組織中都有分布具不同亞型，比如腦、心臟、肺、胰腺、腸、脂肪組織及腎臟等[5]，Ghrelin具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)與其具有廣泛的受體分布有緊密聯(lián)系。研究表明，Ghrelin異常高表達具有促使細(xì)胞過度增殖及其惡性轉(zhuǎn)化的作用，另外研究還證明，Ghrelin與部分腫瘤在病發(fā)和惡化發(fā)展過程中有著緊密的關(guān)系，但是在肺癌中Ghrelin與其相互之間的作用關(guān)系當(dāng)前還無法明確。

Ghrelin在腫瘤的發(fā)生過程中可能具有一定的意義，因為大量的研究研究表明，Ghrelin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的垂體瘤[6]、乳腺癌組織和細(xì)胞株[7]、胃神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞增生和腸癌[6]、甲狀腺濾泡狀癌、甲狀腺癌細(xì)胞株[8]等多種上皮細(xì)胞起源的腫瘤組織及其癌細(xì)胞株中存在表現(xiàn)情況，也有相關(guān)報道顯示，Ghrelin在部分的固醇類組織也能表達，包括睪丸、前列腺等[9]。發(fā)現(xiàn)Ghrelin和GHS-Rla的mRNA和蛋白兩者同時都在前列腺癌細(xì)胞株（ALVA41、DU145、LNCaP和PC-3）中表達[10]。研究表明Ghrelin起到了一種促癌基因的作用，能夠促進腫瘤的發(fā)生及其發(fā)展。但是另外的一些研究卻認(rèn)為，Ghrelin可能起到了一種抑癌基因的作用，抑制了乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌細(xì)胞株的增殖，因為在臨床中不同類型的組織、細(xì)胞以及采用差異化的實驗方法都能引致兩者的結(jié)果出現(xiàn)不一致的情況。

據(jù)研究報道[11]顯示，Ghrelin GHS-1a mRNA的表達情況在不同的分泌性，包括內(nèi)分泌和非內(nèi)分泌性的肺癌組織中均可能實現(xiàn)。Karapanagiotou等[12]臨床實踐中通過對101例不能接受相關(guān)手術(shù)的NSCLC患者進行檢測，并選擇正常健康人的血清60例作為對照，檢測Ghrelin的結(jié)果表明，Ghrelin水平在肺癌病患中明顯高于健康者（P＜0.05），提示肺癌的形成可能與患者的Ghrelin水平增高具有相關(guān)性。本次研究結(jié)果表明，Ghrelin表達在陽性率上肺癌組織的表達情況明顯要比肺正常組織者要高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果顯示，Ghrelin表達增高、活性增強從而使得急速了細(xì)胞周期、促進細(xì)胞在增殖上的速率，參與到肺癌的形成病發(fā)及發(fā)展等過程中；此外，有學(xué)者研究認(rèn)為肺癌發(fā)病的主要因素之一就是因為出現(xiàn)細(xì)胞凋亡障礙問題，而該問題的產(chǎn)生與Ghrelin被激活、與細(xì)胞凋亡有關(guān)的抑癌基因p73等下游基因發(fā)生突變有直接的關(guān)系。本次研究結(jié)果還表明，生長激素釋放肽在肺癌組織中表達與臨床病理參數(shù)之間不存在統(tǒng)計學(xué)差異的包括性別、吸煙與否、分化程度、病理分型，即P＞0.05，生長激素釋放肽在肺癌組織中表達與臨床病理參數(shù)之間存在統(tǒng)計學(xué)差異的為臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否，即P＜0.05。臨床分期越晚，表達越高；肺癌組織中，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的Ghrelin表達明顯比無轉(zhuǎn)移的高，提示肺癌組織中的淋巴轉(zhuǎn)移與Ghrelin有相關(guān)性。

綜上所述，Ghrelin表達與肺癌的形成與發(fā)展存在密切的關(guān)系，對于肺癌早期診斷有積極的意義，并作為一個重要的指標(biāo)應(yīng)用于肺癌的診斷中，在研究結(jié)果中顯示，患者受到肺癌的侵襲后，發(fā)生轉(zhuǎn)移的過程與Ghrelin的表達也存在明顯的關(guān)系，表明腫瘤具有比較高的浸潤性及其不良預(yù)后。

[1]Kojima M，Hosoda H，Data Y，et al.Ghrelin is hormone releasing acylated peptide from stomach[J].Nature，1999，402（6762）：656-660.

[2]Gualillo O，Caminos JE，Blamco M，et al.Ghrelin，a novel placental derived hormone[J].Endocrinology，2001，142（2）：788-794.

[3]Peino R，Baldell IR，Rodrigue-Garcia J，et al.Ghrelin induced growth hormone secretion in humans[J].Eur J Clin Endocrinol，2000，143（6）：11-14.

[4]Mori K，Yoshimoto A，Takaya K，et al.Kidney produces a novel acylated peptide ghrelin[J].FEBS Lett，2000，486（3）：213-216.

[5]Papatt IM，Ghe C，Casson IP，et al.Growth hormone secretagogue binding sites in peripheral human tissues[J].Clin Endocrinol Metab，2000，85（10）：3803-3807.

[6]Korbonits M，Bustin SA，Kojim M，et al.The expression of the growth hormone secretagogue receptor ligand in normaland abnormal human pituitary and other neuroendocrine tumors[J].J Clin Endocrinol Metab，2001，86（2）：881-887.

[7]Cassoni P，Papotti M，Ghe C，et al.Identification，characterization and biological activity of specific receptors for natural（ghrelin）and synthetic growth hormone secretagogues and analogs in human breast carcinomas and cell lines[J].J Clin Endocrinol Metab，2001，86（4）：1738-1745.

[8]Kanamoto N，Akamim T，Hosoda H，et al.Substantial production of ghrelin by a human medulley thyroid carcinonm cell line[J].J Clin Endocrinol Metab，2001，86（10）：4984-4990.

[9]Tena SM，Barreiro ML，Gonzalez LC.Novel expression and functional role of ghrelin in rat testis[J].Endocrinology，2002，143（2）：717-725.

[10]Jefery PL，Herinston AC，Chopin IX.Expression and action of the growth hormone releasing peptide ghrelin and its receptor in prostate cancer cell lines[J].J Endocrinol，2002，172（3）：7-11.

[11]Dixit VD，Schafer EM，Pyle RS，et al.Ghrelin inhibits leptin and activation induced proinflammatory cytokine expression by human monocytes and T cells[J].J Clin Invest，2004，l14（1）：57-66.

[12]Karapanagiotou EM，Polyzos A，Dilana KD，et al.Increased serum levels of ghrelin at diagnosis mediate body weight loss in non-small cell lung cancer（NSCLC）patients[J].Lung Cance，2009，66（3）：393-398.