應(yīng)龍彬，俞桑桑，劉催萍，何仁鋒，壽珍珍，胡根新，歐陽由男，沈 波

（1.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310036；2.中國水稻研究所水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310006）

高效液相色譜法對黑米中花色苷成分的測定

應(yīng)龍彬1，俞桑桑1，劉催萍1，何仁鋒1，壽珍珍1，胡根新1，歐陽由男2，沈 波1

（1.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310036；2.中國水稻研究所水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310006）

建立高效液相色譜（HPLC）檢測黑米中花色苷類物質(zhì)的方法.黑米粉經(jīng)石油醚和乙酸乙酯去脂后，70%乙醇浸提、超聲波處理、濃縮后，進(jìn)行高效液相檢測.該方法花色苷質(zhì)量濃度在0.005 2～0.052mg/mL內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（R2＝0.999 8），平均回收率為99.72%，RSD為0.91%，花色苷最低檢測限為0.1ng/mL.該方法操作簡便快速，精密度和穩(wěn)定性好，可用于從黑色稻米種質(zhì)資源中篩選高花色苷含量的黑米品種.

黑米；花色苷；高效液相色譜

黑色稻米是指糙米（穎果）色澤為黑色的稻米，黑米成熟過程中，會在種皮內(nèi)積聚大量花色苷色素，從而使其糙米呈現(xiàn)棕紅色、紫紅色、紫黑色乃至黑色等顏色［1－2］.研究表明，黑色素普遍存在于生物界，屬于花色苷類化合物，可能結(jié)構(gòu)有矢車菊素－5－葡萄糖苷、天竺葵－3－麥芽糖苷－5－葡萄糖苷等［3－5］.黑米花色苷作為一種天然食用色素，安全無毒、色彩鮮艷，是黑米具有藥效的化學(xué)基礎(chǔ)，具有廣泛的疾病預(yù)防和健康促進(jìn)作用，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力［6－8］.

目前對黑米花色苷的研究主要集中在花色苷資源分布的評價(jià)與資源庫的建立、花色苷的生理活性與功能研究、花色苷的高效提取與綠色分離技術(shù)研究等方面，對黑米中花色苷成分的分析報(bào)導(dǎo)較少［9－13］.本研究應(yīng)用高壓液相色譜法（HPLC）檢測黑米中花色苷的主要成分并作一探討，以期為進(jìn)一步從黑色稻米種質(zhì)資源中篩選高花色苷含量和較純花色苷組分的黑米品種奠定技術(shù)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以黑稻品種黑占86、花葉藥糯和九阡黑糯為材料，由中國水稻研究所國家水稻種質(zhì)資源中期庫提供.

1.2 儀器與試劑

Waters600高效液相色譜儀，2487紫外檢測器，數(shù)據(jù)采集和處理均在Waters工作站進(jìn)行.

所用黑色素為矢車菊素－3－葡萄糖苷（cyanidin－3－glucoside）標(biāo)準(zhǔn)品，由上海安譜科學(xué)儀器公司提供；甲醇、甲酸為色譜純，HP公司產(chǎn)品；水為超純凈水；乙酸乙酯、石油醚為分析純.

1.3 色譜條件

色譜柱為Waters公司的Hanbon Benetnach C18柱（4.6mm i.d×250mm，5μm）.測定條件：流動相為甲醇－水（含1%甲酸），梯度洗脫（柱溫：30℃）（0～3min甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，3～25min甲醇由20%升至30%，25～35min甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，35～40min甲醇由30%降至20%，40～45min甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%），流速為1mL/min，時(shí)間45min.矢車菊素葡萄糖苷溶液的檢測波長為275nm，進(jìn)樣量為10μL.

1.4 供試品溶液的制備

供試品溶液的制備參照文獻(xiàn)［14－16］進(jìn)行.以成熟的黑米為原料，烘干粉碎過篩，獲得實(shí)驗(yàn)用黑米粉.稱取5g黑米粉，先后用石油醚和乙酸乙酯（固液比1∶10）超聲去脂15min，風(fēng)干.加入pH為2.0的70%乙醇（固液比1∶10），70℃水浴回流90min，提取2次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用10mL甲醇溶解，HPLC上樣.

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱量矢車菊素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品1.3mg，用甲醇溶解，定容至25mL，配制得到0.052mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液.使用前配制成0.005 2～0.052mg/mL各質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液.

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

黑色素屬于花色苷類化合物，在波長275nm和525nm處有較強(qiáng)吸收.為了確定矢車菊素葡萄糖苷甲醇溶液的適宜吸收峰，進(jìn)行275nm和525nm波長的檢測.結(jié)果（圖1）顯示，與525nm檢測波長相比，275nm處有最大的響應(yīng)，雜質(zhì)的吸收峰較小，且基線波動較小，從而確定適宜檢測波長為275nm.

2.2 HPLC分離條件的確定

花色苷類為弱酸性物質(zhì)，在中性洗脫條件下，峰形易拖尾，需在流動相中加入弱有機(jī)酸，營造弱酸性環(huán)境［15］.采用甲醇－水洗脫系統(tǒng)并在水相中加入1%的甲酸，避免峰形太寬；同時(shí)，為減少雜質(zhì)峰對目標(biāo)峰形成的干擾，達(dá)到基線分離，以有效地對目標(biāo)峰面積進(jìn)行積分，保證定量分析的準(zhǔn)確性，適當(dāng)延長了分析時(shí)間，使目標(biāo)峰達(dá)到基線分離，確保分離效果明顯.按此優(yōu)化的HPLC分離條件，標(biāo)準(zhǔn)品矢車菊素葡萄糖苷的保留時(shí)間為26.4min（圖2）.

圖1 矢車菊素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品在275nm和525nm的色譜圖Fig.1 Chromatogram of cyanidin－3－glucoside standards in 275nm and 525nm

圖2 矢車菊素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.2 Chromatogram of cyanidin－3－glucoside standards

2.3 花色苷標(biāo)準(zhǔn)液的測定

將質(zhì)量濃度為5.2～52μg/mL的矢車菊素－3－葡萄糖苷各標(biāo)準(zhǔn)品溶液，HPLC逐個(gè)進(jìn)樣，重復(fù)3次，計(jì)算平均峰面積.以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）.當(dāng)矢車菊素葡萄糖苷在5.2～52μg/mL之間時(shí)，其質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程y＝7 179.6x－2 160.8，r＝0.999 6.最低檢測限為0.1μg/mL.

將黑占86、花葉藥糯和九阡黑糯黑色素的樣品溶液分別進(jìn)樣，結(jié)果顯示，3個(gè)黑米品種的花色苷成分均在26.4min處出現(xiàn)相應(yīng)的峰，且與相鄰峰基本達(dá)到基線分離，分離效果較好（圖4A，B，C）.取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、6、8h進(jìn)樣，測得峰面積分別為34 078、34 152、34 210、34 410和34 621，平均值為34 294.2，保留時(shí)間的RSD為0.64%，表明進(jìn)樣精密度良好.

圖3 矢車菊素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of cyanidin－3－glucoside standards

2.4 樣品含量測定和回收率

3個(gè)黑米品種經(jīng)提取純化后，HPLC上樣.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液的保留時(shí)間和樣品的峰面積，測得黑占86、花葉藥糯和九阡黑糯的矢車菊素葡萄糖苷質(zhì)量濃度分別是0.032、0.139、0.525mg/g鮮重.

圖4 不同黑米品種中矢車菊素葡萄糖苷的色譜圖Fig.4 Chromatogram of cyanidin－3－glucoside in different black rice varieties

精確稱取0.5g已知含量的黑占86米粉5份，分別加入0.06mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品矢車菊素葡萄糖苷2mL，按供試品溶液制備，進(jìn)樣10μL，測定含量.結(jié)果顯示，平均回收率為99.72%，RSD為0.91%.

3 討 論

目前，黑色素既可以通過酪氨酸或其衍生物的氧化進(jìn)行化學(xué)合成，也可以從動植物材料中提取.相比而言，從植物中直接提取的天然黑色素安全性較高，應(yīng)用范圍更廣，但生產(chǎn)中仍缺乏黑色素含量較高且具有開發(fā)利用價(jià)值的原料［17］.因此利用豐富的黑色稻米品種資源開展相關(guān)研究是很有應(yīng)用前景.

盡管有利用毛細(xì)管電泳化學(xué)衍生熒光檢測技術(shù)，定量分析食品黑色素新方法的報(bào)道［13］，但HPLC由于色譜柱、檢測器等部件的日趨完善，靈敏度、選擇性及數(shù)據(jù)處理能力得到極大地提高，應(yīng)用HPLC分析黑米中花色苷成分更實(shí)用可行.本文通過對HPLC分離條件的優(yōu)化，建立了適宜的黑米花色苷成分測定分析的方法，在靈敏度、重現(xiàn)性和回收率等方面可滿足研究要求.

黑米作為重要的特種稻米，研究的重點(diǎn)主要側(cè)重于農(nóng)藝性狀和主要營養(yǎng)成分的評價(jià)和分析.張名位等［18］分析了242份黑米品種，認(rèn)為它們的總抗氧化能力、清除自由基能力、總黃酮和花色苷含量的變幅和變異系數(shù)均較大，表現(xiàn)出明顯的基因型差異.在黑占86、花葉藥糯和九阡黑糯3個(gè)黑米品種中，可以看到矢車菊素－3－葡萄糖苷含量的最大差異達(dá)16倍，一方面表明本文建立的黑米中花色苷成分的HPLC方法是可靠的，另一方面也表明從黑色稻米種質(zhì)資源中篩選高花色苷成分的黑米品種及開展相關(guān)的育種研究是可行的.

［1］陳秀真.黑色稻米的營養(yǎng)特點(diǎn)與保健功能［J］.中國食物與營養(yǎng)，2006（10）：41－43.

［2］王艷龍，石紹福，韓豪，等.中國黑米花色苷研究現(xiàn)狀及展望［J］.中國生化藥物雜志，2010，31（1）：63－65.

［3］Butler M J，Day A W.Fungal melanins：a review［J］.Canadian Journal of Microbiology，1998，44（12）：1115－1136.

［4］馬自超，龐業(yè)珍.天然色素化學(xué)及生產(chǎn)工藝學(xué)［M］.北京：中國林業(yè)出版社，1994.

［5］Paul Meredith，Tadeusz Sarna.The physical and chemical properties of eumelanin［J］.Pigment Cell Res，2006，19（6）：572－594.

［6］Ling Wenhua，Wang Linlin，Ma Jing.Supplementation of the black rice outer layer fraction to rabbits decreases atherosclerotic plaque formation and increases antioxidant status［J］.J Nutr，2002，132（1）：20－26.

［7］Hu Chun，Zawistowski J，Ling Wenhua，etal.Black rice（OryzasativaL.indica）pigmented fraction suppresses both reactive oxygen species and nitric oxide in chemical and biological model systems［J］.J Agric Food Chem，2003，51（18）：5271－5277.

［8］秦玉，凌文華.黑米花色苷提取物膠囊對高血脂癥病人的降血脂作用［J］.食品科學(xué)，2008，29（10）：540－542.

［9］崔麗娜，高榮岐，孫愛清，等.不同基因型玉米籽粒類胡蘿卜素與花色苷色素積累規(guī)律［J］.作物學(xué)報(bào)，2010，36（5）：818－825.

［10］侯方麗，張名位，蘇東曉，等.黑米皮花色苷的大孔樹脂吸附純化研究［J］.華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，2009（1）：100－104.

［11］夏效東，凌文華，鄭琳，等.HPLC法測定黑米皮提取物中花色苷成分及含量［J］.食品科學(xué)，2006，27（2）：206－208.

［12］姜平平，呂曉玲，朱惠麗.花色苷類物質(zhì)分離鑒定方法［J］.中國食品添加劑，2003（4）：108－111.

［13］張曉玲，楊橋，吳文惠，等.食品黑色素毛細(xì)管電泳分析新方法的建立［J］.食品科學(xué)，2008，29（6）：372－375.

［14］江友興，劉希貞，龍小黎，等.黑米成分分析與功能利用［J］.農(nóng)牧產(chǎn)品開發(fā)，1999（8）：8－9.

［15］楊萍，李琳.黑糯玉米黑色素的提取工藝的研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40（6）：97－100.

［16］曾盔，黃斌，王潔，等.黑米黑色素的提取與精制［J］.食品科學(xué)，2006，27（12）：304－307.

［17］王雨，汪佩雅，田志宏，等.甘藍(lán)型油菜種子黑色素提取條件的優(yōu)化［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（23）：11176－11178.

［18］張名位，郭寶江，池建偉，等.不同品種黑米的抗氧化作用及其與總黃酮和花色苷含量的關(guān)系［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（7）：1324－1331.

Determination of Anthocyanin in Black Rice by High Performance Liquid Chromatography

YING Long－bin1，YU Sang－sang1，LIU Cui－ping1，HE Ren－feng1，SHOU Zhen－zhen1，HU Gen－xin1，OUYANG You－nan2，SHEN Bo1

（1.College of Life and Environmental Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China；
2.State Key Laboratory of Rice Biology，China National Rice Research Institute，Hangzhou 310006，China）

The paper proposed a method to detect anthocyanin contents in black rice with HPLC.The black rice flour was extracted with ethyl acetate and petroleum ether under the assistance of ultrasound treatment followed by concentration.Then，the extract was analyzed by high performance liquid chromatography.A good linear relationship determined by HPLC method was observed when anthocyanin concentration was in the range of 0.005 2－0.052mg/mL（R2＝0.999 8）.The average recovery rate for anthocyanin was 99.72%with 0.91%of relative standard deviations（RSD），and the lowest limitation of anthocyanin is 0.1ng/mL.The method，which is simple，stable and accurate，can be used for screening black rice varieties with high anthocyanin contents from black rice germplasm resources.

black rice；anthocyanin；high performance liquid chromatography（HPLC）

S326

A

1674－232X（2012）01－0028－05

11.3969/j.issn.1674－232X.2012.01.006

2011－09－26

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD35B02）；生物科學(xué)國家特色專業(yè)建設(shè)項(xiàng)目.

沈 波（1965—），男，教授，博士，主要從事水稻生理與遺傳研究.E－mail：bshen65＠163.com