黃玉鈿 張 聲 鄭 曦 吳欽穗 黃雙月

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院病理科，福建 福州 350009)

淋巴道轉(zhuǎn)移是乳腺癌最重要的生物學(xué)行為之一，新近研究表明〔1〕，癌的淋巴道轉(zhuǎn)移不是一個(gè)被動(dòng)的過程，癌間質(zhì)淋巴管的生成與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)〔2，3〕和環(huán)氧合酶(COX)-2〔4，5〕與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，我們采用原位雜交法檢測(cè)90例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織和30例乳腺良性病變組織中iNOS和COX-2的mRNA表達(dá)情況，另以免疫組化法檢測(cè)乳腺癌組織中VEGF-C表達(dá)和淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體-1(LYVE-1)標(biāo)記的淋巴管密度(LVD)，分析iNOS、COX-2與乳腺癌淋巴管生成的關(guān)系，探討兩者在乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2000至2006年存檔的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌石蠟包埋組織90例，患者均為女性，年齡30～80歲，并以30例乳腺纖維腺瘤組織作為對(duì)照組，所有病例均有完整臨床資料，術(shù)前均未接受過放化療或免疫治療。乳腺癌組織病理學(xué)分級(jí)采用Bloom-Richardson系統(tǒng)Nottingham改良方案〔6〕;患者臨床分期按照TNM分期法(UICC，2003版)。

1.2 主要試劑與方法 iNOS和COX-2的mRNA寡核苷酸探針及原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物公司，兔抗人多克隆抗體VEGF-C為美國Zymed公司產(chǎn)品(工作濃度為1∶150)，兔抗人多克隆抗體LYVE-1為英國Abcam公司產(chǎn)品(工作濃度為1∶100)，Elivision免疫組化試劑盒購自福州邁新生物公司。寡核苷酸探針原位雜交檢測(cè)和Elivision免疫組化檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行，均設(shè)立陽性及陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷 iNOS、COX-2原位雜交檢測(cè)結(jié)果和VEGF-C免疫組化檢測(cè)結(jié)果的判定均采用半定量法:先將特異性定位于乳腺癌細(xì)胞質(zhì)的染色按著色深淺打分:0分為無色、1分為淡黃、2分為棕黃、3分為棕褐;再將陽性細(xì)胞所占百分比打分:0分為陰性、1分為≤10%、2分為11% ～50%、3分為≥51%，兩種得分乘積≥3分為陽性表達(dá)。采用免疫組化檢測(cè)LYVE-1，其標(biāo)記的LVD按照Schoppmann的方法〔7〕，LYVE-1陽性染色定位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)，染成棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇形成無肌性或纖維性管腔結(jié)構(gòu)均可計(jì)數(shù)為1個(gè)微淋巴管;在低倍鏡下選取5個(gè)微淋巴管密集區(qū)，然后在高倍鏡視野(HPF，×200)下計(jì)數(shù)微淋巴管的數(shù)目，取其平均值作為LVD(個(gè)/HPF)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 iNOS和COX-2 mRNA在乳腺癌中的表達(dá)情況 iNOS和COX-2 mRNA陽性表達(dá)位于乳腺癌細(xì)胞質(zhì)上(見圖1)，兩者在乳腺癌組織中的表達(dá)陽性率分別為66.7%(60/90)，68.9%(62/90)，在良性對(duì)照組中陽性率分別為3.3%(1/30)，6.7%(2/30)，兩者在良惡性乳腺腫瘤中的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。iNOS mRNA表達(dá)與乳腺癌腫瘤大小、臨床分期呈正相關(guān)(P＜0.05)，在不同病理分級(jí)、年齡、有/無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分組中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。乳腺癌COX-2 mRNA表達(dá)與病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期呈正相關(guān)(P＜0.05)，在不同腫瘤大小、年齡分組中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。乳腺癌中iNOS mRNA陽性組的COX-2 mRNA陽性表達(dá)率為76.7%(46/60)，而iNOS mRNA陰性組的COX-2 mRNA陽性率為53.3%(16/30)，iNOS和COX-2的mRNA陽性表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)。

2.2 乳腺良惡性腫瘤組織中LVD和VEGF-C蛋白表達(dá)的差異 LYVE-1陽性定位于乳腺癌間質(zhì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)(見圖1)，LYVE-1標(biāo)記的乳腺癌LVD為(8.03±2.26)個(gè)/HPF，乳腺纖維腺瘤LVD為(1.86±0.97)個(gè)/HPF，差異顯著(P＜0.01)。VEGF-C蛋白表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞質(zhì)上(見圖1)，乳腺癌VEGF-C蛋白表達(dá)陽性率為47.8%(43/90)，乳腺纖維腺瘤VEGF-C陽性率為6.7%(2/30)，差異顯著(P＜0.01)。

2.3 iNOS mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá)與LVD和VEGF-C蛋白表達(dá)的關(guān)系 乳腺癌iNOS陽性組LVD與iNOS陰性組LVD差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。乳腺癌iNOS陽性組VEGF-C蛋白表達(dá)陽性率與iNOS陰性組VEGF-C陽性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

2.4 COX-2 mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá)與LVD和VEGF-C蛋白表達(dá)的關(guān)系 乳腺癌COX-2陽性組LVD與COX-2陰性組LVD差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。乳腺癌COX-2陽性組VEGF-C蛋白表達(dá)陽性率與COX-2陰性組VEGF-C陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表1 iNOS和COX-2 mRNA與乳腺癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系〔n(%)〕

表2 乳腺癌中iNOS和COX-2 mRNA與LVD及VEGF-C蛋白表達(dá)的關(guān)系

圖1 乳腺癌iNOS mRNA、COX-2 mRNA、LYVE-1、VEGF-C的表達(dá)(×400)

3 討論

iNOS是NO合成的關(guān)鍵酶，在正常生理?xiàng)l件下各組織細(xì)胞的iNOS活性幾乎不表達(dá)，當(dāng)遇到細(xì)胞因子、致癌劑等因素時(shí)，無活性的單體聚合成二聚體從而獲得合成NO的能力;iNOS合成的NO濃度可導(dǎo)致氮氧自由基如N2O3的形成，后者可使胺硝化形成亞硝胺，誘發(fā)DNA突變從而引發(fā)腫瘤〔3〕。本研究結(jié)果表明乳腺癌中iNOS mRNA陽性率較良性組顯著提高，且iNOS mRNA陽性率隨乳腺癌腫瘤大小和分期的上升而增高，提示iNOS在乳腺癌的生長侵襲過程中起促進(jìn)作用。

COX-2是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素(PGs)的重要限速酶，在正常組織中無表達(dá)，當(dāng)受到各種生長因子、癌基因等因素刺激時(shí)COX-2得以迅速合成，COX-2的催化產(chǎn)物PGs能引起前致癌物發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)成致癌物，啟動(dòng)腫瘤的發(fā)生〔5〕。本研究顯示乳腺癌COX-2 mRNA陽性率較良性組顯著提高，COX-2 mRNA陽性率與乳腺癌分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期呈正相關(guān)，提示COX-2能顯著提高乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。iNOS和COX-2在正常條件下不表達(dá)，均需一定的病理因素誘導(dǎo)生成，本研究結(jié)果還顯示，乳腺癌組織中iNOS和COX-2兩種基因的mRNA陽性率呈正相關(guān)，表明在致癌因素的誘導(dǎo)下，兩者的轉(zhuǎn)錄合成具有協(xié)同作用，共同促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

LYVE-1是特異性表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的CD44糖蛋白同系化合物，在血管內(nèi)皮細(xì)胞上無表達(dá)，已有研究表明〔8〕，以LYVE-1標(biāo)記乳腺癌間質(zhì)內(nèi)淋巴管并計(jì)算淋巴管密度(LVD)能有效反映乳腺癌的淋巴管生成水平，本研究結(jié)果顯示，乳腺癌LVD水平較乳腺纖維腺瘤顯著提高。VEGF-C基因定位于人染色體4q34，是重要的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)淋巴管的生成〔9〕。本研究顯示，乳腺癌組織中VEGF-C表達(dá)陽性率明顯高于良性對(duì)照組。以上關(guān)于LVD和VEGF-C的研究提示，淋巴管生成在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色;本研究顯示iNOS與乳腺癌組織LVD水平呈正相關(guān)，且iNOS表達(dá)與VEGF-C呈正相關(guān)，提示iNOS能顯著提高乳腺癌組織VEGF-C的表達(dá)，VEGF-C的上調(diào)能使其與淋巴管內(nèi)皮上的特異性受體VEGFR-3的結(jié)合得以增強(qiáng)〔10〕，刺激淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞生長，維持淋巴管的完整性，促進(jìn)淋巴管生成，提高乳腺癌LVD水平，進(jìn)而促使癌細(xì)胞通過淋巴管向周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果還顯示COX-2與乳腺癌LVD水平呈正相關(guān)，但與VEGF-C無明顯相關(guān)，COX-2與iNOS均能提高乳腺癌的淋巴管生成水平，關(guān)于COX-2促淋巴管生成的途徑有待進(jìn)一步研究，但兩者均有望作為抗乳腺癌淋巴管生成的靶點(diǎn)應(yīng)用于乳腺癌的臨床治療。

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