趙長祺 于海龍 楊坤寶 趙耀紅 路國兵 (承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河北 承德 067000)

甲狀腺癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，其中甲狀腺乳頭狀癌(PTC)約占甲狀腺癌的60% ～70%〔1〕。國內(nèi)外研究表明，甲狀腺癌是多因素作用的結(jié)果，其發(fā)生的具體機(jī)制尚未完全揭示。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)是一種多功能的細(xì)胞因子，其中TGF-β1在調(diào)節(jié)甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中起到了重要作用，對腫瘤的生長有促進(jìn)作用〔2〕。本文采用免疫組化法和Western印跡檢測TGF-β1在甲狀腺癌組織及正常組織中的表達(dá)，探討二者在甲狀腺癌治療上的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本 2009年9月至2010年8月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的甲狀腺乳頭狀癌組織標(biāo)本60例，癌周組織20例，年齡45～65歲，其中男21例，女39例?；颊吲R床資料完整，術(shù)前均未接受化療和放療，均為經(jīng)典根治術(shù)，經(jīng)病理檢查證實均為原發(fā)甲狀腺乳頭狀癌。所有臨床病理標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水透明、浸蠟、包埋，連續(xù)切片，切片厚4 μm，用于TGF-β1免疫組織化學(xué)染色;臨床病理標(biāo)本新鮮組織用于蛋白印記雜交檢測。

1.2 主要試劑 兔抗TGF-β1多克隆抗體(美國Sigma公司);羊抗兔IgG二抗(美國Rockland公司);免疫組化試劑盒(美國Invitrogen公司)。

1.3 TGF-β1蛋白免疫組化染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，微波修復(fù)抗原室溫孵育20 min，以消化內(nèi)源性過氧化物酶，10%正常羊血清封閉30 min，分別加一抗TGF-β1，濕盒中孵育，4℃過夜，滴加二抗，Envision試劑室溫孵育1 h。各步驟間均以0.01 mol/L PBS緩沖溶液沖洗5 min連續(xù)3次。顯微鏡下控制顯色時間，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察、照相。用PBS緩沖溶液代替一抗作為陰性對照，以甲狀腺乳頭狀癌癌周組織作對照組。細(xì)胞質(zhì)和部分細(xì)胞核著棕色顆粒者為TGF-β1陽性，不著色者為陰性。

1.4 TGF-β1蛋白印記雜交檢測 提取組織總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量，應(yīng)用蛋白印記雜交法對甲狀腺癌及癌周組織TGF-β1的蛋白水平進(jìn)行檢測。一抗選用兔抗TGF-β1多克隆抗體，二抗選用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，β-actin作為內(nèi)參，應(yīng)用Western印跡方法檢測甲狀腺癌及癌周組織TGF-β1蛋白的表達(dá)水平。蛋白上樣量40 μg，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體孵育(一抗終濃度2 μg/ml)，采用化學(xué)發(fā)光法顯色，暗室X光膠片曝光，采用Alpha Innotech軟件分析照片中蛋白條帶的灰度值，并計算各待測條帶與其相應(yīng)內(nèi)參β-actin的灰度值比值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，組間差異顯著性用方差分析法檢驗，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1在甲狀腺癌組織中的表達(dá) TGF-β1陽性染色呈棕黃色細(xì)顆粒狀，前者主要表達(dá)于胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核也有表達(dá)，后者主要表達(dá)在甲狀腺癌周圍間質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞。TGF-β1甲狀腺乳頭狀癌組織中的陽性表達(dá)(70.26%±12.39%)明顯高于癌周組織(33.27% ±6.98%)(P＜0.05)。見圖1。

圖1 甲狀腺乳頭狀癌TGF-β1表達(dá)，胞質(zhì)內(nèi)可見棕黃色的陽性顆粒(×200)

2.2 甲狀腺乳頭狀癌組織中TGF-β1的相關(guān)性 對甲狀腺乳頭狀癌及癌周組織TGF-β1蛋白的Western印跡檢測結(jié)果，見圖2。TGF-β1蛋白分子量為25 kD，與空白對照組相比，甲狀腺乳頭狀癌組織中TGF-β1蛋白的表達(dá)明顯升高。以各待測條帶與其相應(yīng)內(nèi)參β-actin的灰度值比值做統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果表明，與空白癌周組織TGF-β1(0.32±0.04)相比，甲狀腺癌組織TGF-β1蛋白的表達(dá)(0.71±0.13)顯著上調(diào)。見圖2。

圖2 甲狀腺乳頭狀癌中TGF-β1的表達(dá)

3 討論

TGF-β1為25 kD的二聚體多肽，主要在內(nèi)皮細(xì)胞、血細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞和上皮細(xì)胞中表達(dá)。目前認(rèn)為，TGF-β1促進(jìn)腫瘤發(fā)生機(jī)制并非直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，而是腫瘤細(xì)胞對TGF-β1誘導(dǎo)的抑制信號失去敏感性，以及TGF-β1抑制免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤基質(zhì)生成等多種生物學(xué)作用的結(jié)果，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的多功能細(xì)胞因子〔3〕。TGF-β1還可促使血管生成，刺激血管平滑肌細(xì)胞增生和分化，使血管樣結(jié)構(gòu)成為穩(wěn)定的、成熟的血管床，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移〔4〕。本研究表明，TGF-β1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達(dá)顯著高于癌周組織。提示，TGF-β1與甲狀腺腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)，且其在蛋白水平上具有促進(jìn)腫瘤血管生成、侵襲的能力。

綜上，甲狀腺乳頭狀癌TGF-β1的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)，TGF-β1表達(dá)逐漸增強(qiáng)，是甲狀腺乳頭狀癌病情進(jìn)展和腫瘤轉(zhuǎn)移的重要信號。TGF-β1表達(dá)越高，腫瘤轉(zhuǎn)移性越強(qiáng)，預(yù)后越差。提示甲狀腺乳頭狀癌中TGF-β1表達(dá)水平可作為判斷臨床療效和預(yù)后的指標(biāo)。

1 Singh N，Rogers P，Atwood CW，et al.Short-course empiric antibiotic therapy for patients with pulmonary infiltrates in the intensive cane unit〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2000;162(2):505-11.

2 Tovng PL，Chan WY.Decreased expression of human papillo mavirus E2 protein and transforming growth factor-beta l in human cervical neoplasia as nearly marker in carcinogenesis〔J〕.J Surg Oncol，2003;84(1):17-23.

3 Shariat SF，Kim JH，Andrews B，et al.Preoperative plasma levels of transforming growth factor beta 1 strongly predict clinical outcome in patients with bladder carcinoma〔J〕.Cancer，2001;92(12):2985-92.

4 丁國芳，徐銀峰，楊最素，等.TGF-β1在前列腺癌中的表達(dá)及其與生存率關(guān)系的研究〔J〕.浙江醫(yī)學(xué)，2006;28(9):709-11.