舒 磊 杭州市紅十字會醫(yī)院 杭州 310003

支氣管哮喘（asthma）是兒童最常見的呼吸系統(tǒng)變態(tài)反應性疾病，是由嗜酸粒細胞、肥大細胞和T淋巴細胞等多種炎癥細胞參與的氣道急、慢性疾病，多為過敏性炎癥。2003年中國大陸13～14歲兒童中自覺有喘息癥狀的患病率大約為4%[1]。呼吸道的急性炎癥可使氣道管壁血管通透性增加、黏液分泌增多、平滑肌痙攣；而慢性炎癥可進一步改變氣道結構和功能，致使氣道高反應性，引起喘息、咳嗽和呼吸困難等癥狀[2]。全世界早已達成共識，哮喘是由遺傳、環(huán)境以及其他因素共同作用而引起的一種多基因、復雜性遺傳病，并表現(xiàn)出強烈的遺傳異質性和表型異質性[3]。迄今，科學家們已運用了各種方法，包括家系連鎖關聯(lián)分析、全基因組微衛(wèi)星連鎖分析、全基因組單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）掃描、綜合分析（meta-analysis）等，以求揭示哮喘的遺傳學基礎。截止目前，全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了100多個基因可能與哮喘的發(fā)生相關，所涉及的染色體區(qū)域包括 2p16、2p25、2q33、5q31-q33、7p14-p15、7q21、11q12-q13、12q24、14q24、19p13、20p12、20p13和20q13等[3]。我們研究了在哮喘發(fā)病中具有重要作用的IL-13基因的2個SNP位點：位于第4外顯子編碼區(qū)的rs20541和位于基因轉錄啟動子區(qū)域的rs1800925的基因型頻率分布特點及其多態(tài)性與兒童哮喘發(fā)病的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本組哮喘患者105例，男65例，女40例，年齡4～15歲，平均9.5歲；所有患者均符合中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組制定的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》中的診斷標準，并仔細詢問既往史、家族過敏史。其中具有家族史38例（男21例，女17例）。同時以近2周內無呼吸道感染癥狀，本人及三代以內的直系親屬無過敏史且既往無哮喘及反復呼吸道感染病史的112名健康漢族兒童為對照組，男58名，女54名，年齡4～16歲，平均8.3歲。

1.2 方 法 樣本DNA提取 ①一次性抽取外周血5mL，以EDTA抗凝，用TIANamp Blood DNA Kit（北京天根生物工程公司）常規(guī)提純基因組DNA。②用全基因組DNA分別擴增含有rs20541和rs1800925兩個位點的DNA片段。PCR引物序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

PCR反應體系總體積50μL，其中包括引物各15pmol，1U Taq DNA 聚合酶，2.5mmol/LMgCl2，200 mmol/L dNTP和模板DNA 0.5μg。PCR反應條件：預變性95℃ lmin，95℃ lmin，60℃ 1min，72℃ lmin，共30個循環(huán)；延伸72℃5min（擴增儀為GeneAmp PCR System 9700）。③rs20541的擴增片段經(jīng)純化后在ABIPRISM 3100型DNA全自動測序儀上進行直接測序分析（由大上海生工生物工程技術服務有限公司完成）。以AS-PCR法分析SNP rs1800925。并隨機抽取部分樣本進行DNA直接測序，以保證基因分型結果的準確。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.0進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 rs20541基因型與哮喘發(fā)病的關聯(lián)性 經(jīng)χ2檢驗，哮喘組和正常對照組的IL-13 Arg130Gln（rs20541）基因型和等位基因的頻率分布差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

2.2 rs1800925基因型與哮喘的關聯(lián)性 經(jīng)χ2檢驗，哮喘組和正常對照組的IL-13C-1111T（rs1800925）基因型和等位基因的頻率分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表2 兩組IL-13基因rs20541位點的等位基因頻率分布 例（%）

表3 兩組IL-13基因rs1800925位點的等位基因頻率分布 例（%）

3 討論

白細胞介素-13基因是（interleukin13，IL-13）位于人類染色體5q31，全長9937 bp，含有4個外顯子，轉錄片段長1283 bp，編碼含146個氨基酸殘基的IL-13細胞因子[4]。IL-13基因為細胞因子基因家族成員，與IL-3、IL-5、IL-4以及CSF2簇集位于5q上。這些基因的結構相似，在5q23-q31區(qū)域上的排布順序 為 ：cen-IL-3-CSF2-IL-13-IL-4- IL-5--tel。IL-13促使CD23在B細胞上表達，增強CD72和MHC II抗原的表達，促進IgE重鏈基因在B細胞上轉錄[5]。Zhu等[6]的研究表明，IL-13與酸性哺乳動物幾丁質酶（acidicmammalian chitinase）介導的通路，在哮喘動物模型和哮喘患者的組織中表現(xiàn)出強烈的相關性。已經(jīng)完成的多項研究顯示，哮喘患者的氣道中存在IL-13分子，IL-13可介導哮喘的多個主要特征（包括氣道的高反應性、黏膜上皮化生、氣道成纖維細胞的活化和增殖等），故IL-13基因與哮喘的診斷和治療息息相關。

IL-13基因上存在不少的SNP位點，在哮喘患者中呈現(xiàn)強烈的連鎖不平衡，如位于第3內含子中的+1923C→T，位 于 第 4外 顯 子 中 的 +2044G→A（rs20541），位于3'非翻譯區(qū)的+2525G→A、+2580C→A 和+2749C→T，位 于 啟 動 子 中 的-1512A→C（rs1881457）和-1112C→T（rs1800925）等[5]。相關研究發(fā)現(xiàn)，IL-13的SNP 位點+2044G→A（rs20541）分別與血清IgE水平升高、嗜酸粒細胞增多、哮喘、過敏性皮炎和變應原皮試陽性等呈正相關[7]，而SNP位點-1112C→T（rs1800925）則分別與哮喘、氣道高反應性和變應原皮試陽性、IgE水平、食物過敏等相關聯(lián)[8]。

近5年來，全世界對哮喘與IL-13基因型相關性研究較多。Wu等[9]對252名中國中部地區(qū)哮喘患兒進行基因分型后發(fā)現(xiàn)，rs20541這個SNP位點表現(xiàn)出強烈的哮喘相關性，+2044A這種基因型為哮喘的遺傳相關性。在亞洲地區(qū)，香港、日本、韓國等地區(qū)的學者分別對300名以上哮喘患兒進行基因分型，發(fā)現(xiàn)+2044G→A（rs20541）和-1112C→T（rs1800925）位點與哮喘遺傳性具有強烈的相關性[9-10]。

在本研究中，兩組+2044G→A（rs20541）基因型頻率分布表現(xiàn)出顯著差異。而-1112C→T（rs1800925）的基因型頻率分布無顯著差異。本研究的患者均來自于中國浙江地區(qū)，而且研究的樣本數(shù)又相對偏小，所以研究結果與以前文獻報道可能會存在有一些差異。

［1］MasoliM，F(xiàn)abian D，Holt S，etal.The globalburden ofasthma:executive summary of the GINA Dissemination Committee report［J］.Allergy，2004，59（5）:469-478.

［2］Tattersfield AE，Knox AJ，Britton JR，etal.Asthma［J］.Lancet，2002，360（9342）:1313-1322.

［3］London SJ，Romieu I.Gene by environment interaction in asthma［J］.Annu Rev Public Health，2009，30:55-80.

［4］McKenzie AN，Culpepper JA，deWaalMalefytR，etal.Interleukin 13，a T-cell-derived cytokine that regulates human monocyte and B-cell function［J］.Proc Natl Acad SciUSA，1993，90（8）:3735-3739.

［5］Punnonen J，Aversa G，Cocks BG，et al.Interleukin 13 induces interleukin 4-independent IgG4 and IgE synthesis and CD23 expression by human B cells［J］.Proc Natl Acad SciUSA，1993，90（8）:3730-3734.

［6］Zhu Z，Zheng T，Homer RJ，etal.Acidicmammalian chitinase in asthmatic Th2 inflammation and IL-13 pathway activation［J］.Science，2004，304（5677）:1678-1682.

［7］Hunninghake GM，Soto-Quiros ME，Avila L，etal.Polymorphisms in IL-13，total IgE，eosinophilia，and asthma exacerbations in childhood［J］.JAllergy Clin Immunol，2007，120（1）:84-90.

［8］Liu X，Nickel R，Beyer K，et al.An IL-13 coding region variant is associated with a high total serum IgE level and atopic dermatitis in the German multicenter atopy study（MAS-90）［J］.JAllergy Clin Immunol，2000，106（1Pt1）:167-170.

［9］Wu X，Li Y，Chen Q，etal.Association and gene-gene interactions of eight common single-nucleotide polymorphisms with pediatric asthma in middle China［J］.JAsthma，2010，47（3）:238-244.

［10］Heinzmann A，Brugger M，Bierbaum S，et al.Joint influences of Acidic-Mammalian-Chitinase with Interleukin-4 and Toll-like receptor-10 with Interleukin-13 in the genetics of asthma［J］.Pediatr Allergy Immunol，2010，21（4 Pt2）:e679-e686.