胡伊樂(lè)，郭紹芳，涂心明

在治療一些因基因缺陷造成的先天性疾病時(shí)，傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療不能取得良好的效果，尋求一種新的治療方法成為研究的熱點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，生命科學(xué)許多領(lǐng)域的研究都發(fā)生了質(zhì)的飛躍[1]?；蚩寺?、測(cè)序、基因表達(dá)等分子生物學(xué)研究方法的日臻成熟, 為轉(zhuǎn)基因技術(shù)的產(chǎn)生奠定了基礎(chǔ)，也為這些疾病的治療提供了一種新的方法。在基因治療中以真核載體為代表的非病毒載體以其制備方便、低毒、低免疫反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)越來(lái)越多地被應(yīng)用于臨床與科研中[2]。真核載體由于不整合入機(jī)體細(xì)胞基因組，隨著細(xì)胞的分裂與增殖其表達(dá)能力逐漸衰減，需要不斷有新的外源性基因補(bǔ)充。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)PCDNA3.1(+)-EGFP、pEGFP-C3、pIRES-GFP 3種綠色熒光真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)時(shí)間，并將前腦啡肽原基因連接到pEGFP-C3、pIRES-GFP上使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，根據(jù)細(xì)胞上清液放免結(jié)果推斷出真核載體的表達(dá)時(shí)效，為基因治療的給藥間隔提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；PCDNA3.1(+)-EGFP、pEGFP-C3、pIRES-GFP綠色熒光載體由河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；NIH3T3細(xì)胞來(lái)自河南省農(nóng)科院；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、凍存管購(gòu)自上海寶生物有限公司；RT-PCR試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、G418購(gòu)自鄭州天根生物有限公司；亮氨酸腦啡肽(L-ENK)放免試劑盒購(gòu)置于第二軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究所。

1.2綠色熒光載體-PENK載體的構(gòu)建取大鼠腦組織液氮冷凍后研碎，提取腦組織總RNA。設(shè)計(jì)并制備兩端加上相應(yīng)酶切位點(diǎn)的引物，逆轉(zhuǎn)錄獲單鏈cDNA，PCR擴(kuò)增大鼠前腦啡肽原基因PENK。將獲取的大鼠前腦啡肽原基因雙酶切，連接到pEGFP-C3、pIRES-GFP綠色熒光載體上獲得pEGFP-C3-PENK、pIRES-GFP-PENK重組載體。

1.3體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)與檢測(cè)解凍NIH3T3細(xì)胞并傳代3次以保證細(xì)胞活性的恢復(fù)，轉(zhuǎn)入6孔培養(yǎng)板待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底部達(dá)75%時(shí)，按脂質(zhì)體2000說(shuō)明書(shū)操作步驟將PCDNA3.1(+)-EGFP重組質(zhì)粒pEGFP-C3-PENK、pIRES-GFP-PENK與NIH3T3細(xì)胞按比例混合繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)。

1.4陽(yáng)性細(xì)胞的觀察與統(tǒng)計(jì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h換含有胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并觀察其轉(zhuǎn)染效果、48 h時(shí)進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞綠色熒光的表達(dá)，此后每隔48 h在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，每孔在40倍視野下隨即選取6個(gè)視野，記錄每個(gè)視野中顯示綠色熒光的陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，將6視野細(xì)胞數(shù)求和并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5細(xì)胞上清液放免測(cè)定由于腦啡肽容易被降解，為保證放免結(jié)果的準(zhǔn)確性，每次觀察細(xì)胞時(shí)取0.5 mL細(xì)胞上清液，迅速置95℃水浴鍋中使其固定保存。利用亮氨酸腦啡肽放免試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清液中腦啡肽的濃度。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞綠色熒光的表達(dá)轉(zhuǎn)染3種真核質(zhì)粒的細(xì)胞綠色熒光的表達(dá)見(jiàn)圖1。

圖1 48 h時(shí)3種真核質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)

2.2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后陽(yáng)性細(xì)胞在40倍視野下隨機(jī)選取6個(gè)視野之和見(jiàn)圖2，綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在48 h時(shí)達(dá)高峰，持續(xù)表達(dá)35 d后開(kāi)始下降。

圖2 3種質(zhì)粒陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量

圖3 細(xì)胞上清液放免檢測(cè)結(jié)果

2.3細(xì)胞上清液放免檢測(cè)結(jié)果pEGFP-C3-PENK, pIRES-GFP-sPENK重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后上清液放免檢測(cè)結(jié)果顯示48 h達(dá)高峰(852.37±76.82)pg/mL,穩(wěn)定表達(dá)32 d后開(kāi)始衰減，變化規(guī)律與細(xì)胞熒光表達(dá)基本符合。動(dòng)態(tài)表達(dá)見(jiàn)圖3。

3 討論

基因治療是隨著分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生的一種新型治療方法，它將外源性治療基因片段連接到某種載體上，轉(zhuǎn)入機(jī)體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，以彌補(bǔ)先天性基因缺陷或不足，從而起到治療作用[3]。1990年在美國(guó)成功進(jìn)行了ADA(腺苷脫氨酶) 缺陷患兒的人體基因治療，開(kāi)創(chuàng)了基因治療在臨床上應(yīng)用的先河。此后基因診斷與治療的研究在科研與臨床上得到廣泛的應(yīng)用。常用的基因治療方法包括基因補(bǔ)償、基因糾正、基因代償、反義技術(shù)等。在基因治療中目前常用的載體多為病毒性載體，該載體雖有良好的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率與染色體整合能力，但其自身存在可控性差、自身免疫原性和潛在的致癌性等缺陷限制了其應(yīng)用[4]。真核載體外源基因整合率低，且具有低毒、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)日益得到廣泛關(guān)注。但真核載體攜帶的目的基因由于沒(méi)有整合入細(xì)胞自身基因組，不具有隨著細(xì)胞的分裂而增殖的能力，其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)能力將隨細(xì)胞的增殖逐漸衰減，這決定了它們?cè)跈C(jī)體內(nèi)的表達(dá)具有一定的表達(dá)時(shí)效。為驗(yàn)證真核載體在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)時(shí)效，為今后的臨床與試驗(yàn)研究提供理論依據(jù)，本試驗(yàn)選用3種目前常用的3種綠色熒光真核載體轉(zhuǎn)染機(jī)體細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的表達(dá)推定真核載體表達(dá)的時(shí)效，同時(shí)在pEGFP-C3、pIRES-GFP載體上連接前腦啡肽原基因，使其在細(xì)胞內(nèi)合成亮氨酸腦啡肽(L-ENK)。由于L-ENK結(jié)構(gòu)小，可以自由出入細(xì)胞膜，在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)放免法檢測(cè)細(xì)胞上清液中L-ENK的濃度，觀察外源基因在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證綠色熒光蛋白的表達(dá)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3種綠色熒光載體在轉(zhuǎn)染NIN3T3細(xì)胞24 h后即開(kāi)始表達(dá)，在36 h即達(dá)到高峰，隨后一直持續(xù)高表達(dá)，在35 d后其表達(dá)開(kāi)始衰減，可一直持續(xù)2個(gè)月以上。L-ENK放免測(cè)定結(jié)果顯示48 h時(shí)達(dá)高峰, 穩(wěn)定表達(dá)32 d后開(kāi)始衰減，變化規(guī)律與細(xì)胞熒光表達(dá)結(jié)果基本符合。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可得出以下結(jié)論：在基因治療中真核質(zhì)粒連接目的基因能在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)約35 d，外源基因補(bǔ)充間隔選定為30 d較為合適。

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