涂心明，郭紹芳，胡伊樂

基因治療是近些年來興起的通過植入外源性治療基因片段，治療各種基因缺陷性疾病的一種新型疾病治療方法。基因治療時需將治療性目的基因片段插入真核質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入機(jī)體細(xì)胞，通過目的基因在體內(nèi)的表達(dá)糾正某些基因缺陷，以達(dá)到治療疾病的目的[1]。由于大多數(shù)治療用真核質(zhì)粒攜帶負(fù)電荷與細(xì)胞膜自身電荷相同，靜電排斥作用使自然情況下裸質(zhì)粒穿越細(xì)胞膜的幾率較低，很難達(dá)到治療濃度[2]。為增加真核質(zhì)粒穿越細(xì)胞膜的幾率，目前常用的方法有增加細(xì)胞膜通透性的氯化鈣、電擊、基因槍等方法[3]，由于對機(jī)體細(xì)胞有損傷，多用于實驗研究，臨床應(yīng)用較少。MPEG-PLGA(聚乳酸-羥基乙酸共聚物)是一類可降解的功能高分子有機(jī)聚合物, 通過美國 FDA認(rèn)證, 具有良好的生物相容性、無毒、無刺激性、無免疫原性和藥物緩釋等特性[4], 在臨床與科研中作為化學(xué)類藥物的給藥載體得到廣泛應(yīng)用，作為真核質(zhì)粒的跨膜轉(zhuǎn)運載體的研究，目前文獻(xiàn)報道較少。本實驗利用MPEG-PLGA包裹綠色熒光真核質(zhì)粒，通過綠色熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)驗證其作為真核質(zhì)?？缒ぽd體的可行性。

1 材料與方法

1.1材料MPEG-PLGA購自山東濟(jì)南岱罡生物技術(shù)有限公司；四季青胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自上海寶生物生物有限公司；pEGFP-C3綠色熒光真核質(zhì)粒與NIH3T3細(xì)胞由河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)實驗室保存；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、凍存管購自鄭州天根生物有限公司。

1.2方法

1.2.1 溶液的配制 ①MPEG-PLGA水溶液的制備：用三角瓶取雙蒸水20 mL，牛皮紙封口后高溫蒸汽消毒，待自然冷卻后置4℃冰箱過夜以備用，無菌環(huán)境下稱取MPEG-PLGA 300 mg，加入已消毒的4℃雙蒸水中，將三角瓶置于冰水混合物中震蕩使其溶解。待溶解完全后，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＂贛PEG-PLGA/DNA納米膠囊復(fù)合物的配制：取260 pg/mL的質(zhì)粒300 μl加入到1 mL上述配制的MPEG-PLGA溶液中在冰水混合物中混勻，在此過程中盡量輕柔以防止破壞質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，室溫放置15 min，置37℃恒溫箱中30 min,即可得到包裹pEGFP-C3的MPEG-PLGA/pEGFP-C3復(fù)合物。

1.2.2 復(fù)合物粒徑檢測 用Malvern粒度測定儀測其MPEG-PLGA/ pEGFP-C3復(fù)合物的粒徑。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗 ①細(xì)胞準(zhǔn)備：液氮保存的細(xì)胞由于很多機(jī)能處于休眠狀態(tài)，為獲取理想的細(xì)胞活性，液氮中凍存的NIH3T3細(xì)胞復(fù)蘇后需傳3代以便細(xì)胞恢復(fù)正?；盍Γ^察細(xì)胞的形態(tài)與機(jī)能恢復(fù)正常后轉(zhuǎn)入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)，等細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底部達(dá)75%時將其分為2組，每組9孔細(xì)胞準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。②細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取去內(nèi)毒素的MPEG-PLGA/pEGFP-C3復(fù)合物加入第1組培養(yǎng)孔中；將pEGFP-C3裸質(zhì)粒加入第2組培養(yǎng)孔中以對照，將兩組混勻后靜置15 min，然后在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。③觀察與陽性細(xì)胞統(tǒng)計：培養(yǎng)48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，每孔在40倍視野下隨即選取6個視野，記錄每個視野中顯示綠色熒光的陽性細(xì)胞的數(shù)量，取均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 MPEG-PLGA/DNA納米膠囊復(fù)合物的粒徑測定結(jié)果如圖1所示，納米粒粒徑呈單式正態(tài)分布，平均粒徑為28.3 nm，多分散系數(shù)為0.21，表明納米粒大小較均勻，分布范圍窄。

3.2細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果熒光顯微鏡下觀察可見，轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞有綠色熒光表達(dá)，48 h達(dá)高峰，兩組結(jié)果見圖2。裸質(zhì)粒組不但熒光表達(dá)弱且僅有少量陽性細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率不足3%，MPEG-PLGA/pEGFP-C3復(fù)合物組陽性細(xì)胞達(dá)15.3%，熒光表達(dá)強(qiáng)。結(jié)果證明MPEG-PLGA/pEGFP-C3復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于裸質(zhì)粒。

圖1 MPEG-PLGA/DNA納米膠囊復(fù)合物粒徑

圖2 兩組轉(zhuǎn)染效果對比圖

3 討論

MPEG-PLGA由乳酸和羥基乙酸兩種單體聚合而成,具有良好的生物相容性,無毒、無刺激、無免疫原性和藥物緩釋等特性，特別是具有很好的中樞神經(jīng)系統(tǒng)生物相容性，分子量0.5～20萬[5]，常作為一些水溶性差、自身性質(zhì)不穩(wěn)定、體內(nèi)代謝快、生物利用度低類化學(xué)藥物的給藥載體，在應(yīng)用中大多采用溶劑揮發(fā)法或透析法等制備微粒膠囊，這些方法大都涉及到二氯甲烷、乙腈、丙酮等有機(jī)溶劑的使用，殘留的有機(jī)溶劑不僅對人體具有很大危害，導(dǎo)致副作用的發(fā)生，而且容易破壞目的基因片段中DNA之間的鏈接，使其發(fā)生斷裂，在基因治療過程中不能正確表達(dá)治療蛋白。為了解決這一問題，本試驗利用共聚物比聚乳酸具有更大的親水性，并且具有溫敏水凝膠的特性(即其水溶液在4℃時完全溶于水，在37℃時變?yōu)樗z[6])提出了一種新型制備納米膠囊的方法——直接溶解法。該方法將MPEG-PLGA溶解于4℃的雙蒸水中，加入真核質(zhì)?；旌虾笾饾u升溫至37℃，利用溫敏水凝膠的特性使其在形成凝膠顆粒時包裹游離在水溶液中的真核質(zhì)粒，形成具有良好生物相容性的MPEG-PLGA/真核質(zhì)粒復(fù)合物，該復(fù)合物穿越細(xì)胞膜后MPEG-PLGA凝膠顆粒在機(jī)體一些催化酶的作用下很快溶解釋放出真核質(zhì)粒，質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)相應(yīng)蛋白從而起到治療疾病的目的，此方法在微粒膠囊制備時沒有劇烈的震蕩和有機(jī)溶劑的參與，可有效保護(hù)目的基因片段的完整性。本試驗中利用細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)觀察MPEG-PLGA/真核質(zhì)粒復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。試驗結(jié)果顯示MPEG-PLGA/真核質(zhì)粒復(fù)合物組轉(zhuǎn)染效率(15.3%)明顯高于作為對照的裸質(zhì)粒組(3%)，證明利用MPEG-PLGA包裹真核質(zhì)?？捎行岣咂滢D(zhuǎn)染效率，另外根據(jù)MPEG-PLGA的特性，可通過改變聚合物單體比例和分子量，調(diào)控共聚物在體內(nèi)的降解速度、DNA包封率以及基因體內(nèi)釋放速度。試驗結(jié)果表明MPEG-PLGA可以作為一種新型跨膜載體在臨床與研究中得以應(yīng)用。

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