盧 敏，龔護民，施 蕾，陳芳榮

(海南省人民醫(yī)院秀英產(chǎn)科，海南 海口 570311)

·實驗研究·

大鼠子癇前期動物模型的建立

盧 敏，龔護民*，施 蕾，陳芳榮

(海南省人民醫(yī)院秀英產(chǎn)科，海南 ?？?570311)

目的 研究子癇前期的病因、發(fā)病機理、治療及預(yù)防方法，建立大鼠子癇前期動物模型。方法 將孕鼠隨機分為兩組，兩組自妊娠第12天起皮下分別注射生理鹽水和亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)，共7d。妊娠第10天起測量大鼠尾動脈收縮壓，1次/d，直至分娩。同時，檢測兩組孕鼠的尿蛋白、肝、腎功能，觀察仔鼠和胎盤的異常改變，并進行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果 對照組孕鼠尾動脈收縮壓隨著妊娠進展有逐漸下降趨勢，而子癇前期組孕鼠尾動脈收縮壓在妊娠第13天后顯著升高。同時子癇前期組孕鼠出現(xiàn)蛋白尿、肝腎功能和組織結(jié)構(gòu)改變、胎鼠發(fā)育遲緩等情況。結(jié)論 注射L-NAME可導(dǎo)致孕鼠產(chǎn)生類似人類子癇前期的表現(xiàn)，而且在病理生理方面也與人類子癇前期極其相似，是一個較為理想的子癇前期動物模型。

大鼠；亞硝基左旋精氨酸甲酯；子癇前期；收縮壓

子癇前期是妊娠中、晚期常見的嚴重并發(fā)癥[1]，臨床表現(xiàn)為妊娠后期出現(xiàn)高血壓、水腫、蛋白尿，嚴重時可導(dǎo)致心、肝、腎功能衰竭及胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩，甚至母嬰死亡，其病因及發(fā)病機理至今尚未完全闡明[2]。近年來，內(nèi)源性一氧化氮(NO)在子癇前期發(fā)病機理中的作用越來越受到重視[3]。亞硝基左旋精氨酸甲酯[4](Nitro L arginine methyl ester，L-NAME)是一種一氧化氮合成酶抑制劑，競爭性抑制體內(nèi)NO的合成。筆者選用L-NAME抑制孕鼠體內(nèi)NO合成，為研究子癇前期建立一個理想的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級成年Wistar大鼠(由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，雌性體重為190～230g，雄性體重為210～260g，在室溫18～28℃、相對濕度40%～70%的環(huán)境中飼養(yǎng)，不控制飼料和飲水。在發(fā)情期，將雌性大鼠和雄性大鼠按2:1比例同籠飼養(yǎng)，每天早晨陰道分泌物鏡檢，發(fā)現(xiàn)精子為妊娠第1天。試驗中意外死亡的孕鼠均予及時補充。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑 亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)購于Sigma公司。

1.2.2 分組與給藥 將孕鼠隨機分為兩組，正常妊娠組和子癇前期組，每組15只。自妊娠第12天開始，兩組孕鼠皮下分別注射生理鹽水(與L-NAME同體積)和L-NAME(劑量為125mg·d-1·kg-1)，共7d。

1.2.3 血壓測定 兩組孕鼠均于妊娠第10天開始測量尾動脈收縮壓，每日清晨1次，直至分娩。測量方法為：先把孕鼠置于預(yù)熱箱內(nèi)預(yù)熱至36℃～38℃，待其安靜后以動物無創(chuàng)血壓測試儀(成都泰盟科技有限公司，原理與測人體肱動脈血壓相似)測量，測3次，取平均值。

1.2.4 尿蛋白測定 分別于妊娠第10天、第20天將大鼠置標準代謝籠內(nèi)飼養(yǎng)，分別收集兩組孕鼠24h尿量，以磺基水楊酸比濁定法測定尿蛋白濃度。

1.2.5 肝、腎功能測定 兩組孕鼠分別于分娩前，乙醚吸入麻醉狀態(tài)下開腹，抽取下腔靜脈血2ml，在室溫下凝結(jié)20min后離心，取血清在HITACHI 7170A全自動生化分析儀上測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)和尿酸(UA)等指標。

1.2.6 仔鼠、胎盤測量 臨分娩前，剖宮取仔，記錄兩組孕鼠的仔鼠數(shù)、畸形率、死胎率，測仔鼠體重、胎盤濕重和面積。

1.2.7 組織病理學(xué)檢查 剖宮產(chǎn)后處死母鼠，取母鼠的子宮胎盤、肝、腎，置入10%甲醛溶液內(nèi)固定24h以上，乙醇系列脫水，透明，石蠟包埋成塊后，連續(xù)切片，HE染色，在光鏡下觀察其組織病理學(xué)改變。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(x-±s)表示，進行t檢驗和方差分析，部分數(shù)據(jù)資料方差不齊，采用近似t檢驗中的Cochran&Cox法。計數(shù)資料用χ2檢驗。檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 血壓測定 正常孕鼠(對照組)尾動脈收縮壓隨著妊娠進展有逐漸下降趨勢，妊娠第10天為(100.8±3.7)mmHg(1mmHg=0.133kPa)，妊娠第20天為(97.3±6.0)mmHg，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。皮下注射L-NAME后24h后，孕鼠(子癇前期組)尾動脈收縮壓顯著升高(P＜0.01)，妊娠第13天為(129.8±3.7)mmHg，妊娠第20天為(134.3±6.0)mmHg(圖1)。

圖1 對照組和子癇前期組孕鼠妊娠中后期血壓變化

2.2 尿蛋白測定 皮下注射L-NAME后，子癇前期孕鼠尿蛋白濃度較正常孕鼠(對照組)顯著增加(P＜0.01)(表1)。

表1 對照組和子癇前期組孕鼠24h尿蛋白的變化(mg/L，±s)

表1 對照組和子癇前期組孕鼠24h尿蛋白的變化(mg/L，±s)

注：與正常對照組比較，*P＜0.01。

組別 只數(shù) 第10天 第20天正常孕鼠子癇前期孕鼠1010410.57±40.50408.90±58.40412.35±62.45795.24±58.86*

2.3 肝、腎功能測定 剖宮產(chǎn)時抽取下腔靜脈血檢測孕鼠血清ALT、TBIL、ALB、BUN、CRE、UA，子癇前期孕鼠均較對照組有顯著升高(P＜0.01)，說明L-NAME對肝、功能有一定影響(表2)。

表2 對照組和子癇前期組孕鼠肝腎功能比較(±s)

表2 對照組和子癇前期組孕鼠肝腎功能比較(±s)

注：與正常對照組比較，*P＜0.01。

組別正常孕鼠子癇前期孕鼠只數(shù)1515ALT(U/L)24.5±6.773.3±7.1*TBIL(mmol/L)16.2±0.725.1±1.4*ALB(g/L)40.5±1.530.5±1.0*BUN(mmol/L)7.2±0.510.1±0.8*CRE(μmol/L)35.6±6.059.9±4.8*UA(μmol/L)110.3±20.4180.4±13.7*

2.4 仔鼠、胎盤測量 子癇前期孕鼠的仔鼠數(shù)目、仔鼠體重、胎盤面積等均遜于正常孕鼠，死胎數(shù)明顯增加(P＜0.01)(表3)，且出現(xiàn)仔鼠后肢短縮畸形。

表3 兩組胎鼠、胎盤、畸形率和死胎率的比較(±s)

表3 兩組胎鼠、胎盤、畸形率和死胎率的比較(±s)

注：與正常對照組比較，*P＜0.01。

組別正常孕鼠子癇前期孕鼠胎鼠數(shù)9268*胎鼠體重(g)5.1±0.44.0±0.3*胎盤面積(cm2)0.78±0.20.33±0.1*畸形率(%)046.1*死胎率(%)030.6*

2.5 組織病理學(xué)檢查 子癇前期孕鼠顯示部分腎小球囊腔內(nèi)有滲出，系膜細胞增生、系膜基質(zhì)增多，腎小動脈壁玻璃樣變性，血管壁增厚，管腔明顯變小，腎小管充滿蛋白管型(圖2A)；肝細胞水泡樣變性及灶性壞死(圖2B)；胎盤蛻膜帶腫脹增厚，炎性細胞浸潤及纖維素樣壞死，基帶滋養(yǎng)葉巨細胞增生，基帶增厚，迷路帶滋養(yǎng)葉細胞增生，伴腫脹肥大、空泡樣變，血間膜增厚伴纖維蛋白沉積(圖2C)。正常對照組孕鼠上述改變較輕(圖2D)。

圖2 兩組孕鼠腎、肝、胎盤組織的病理切片照片(×50倍)

3 討論

子癇前期是妊娠中晚期出現(xiàn)的一種妊娠特異性綜合征。目前，普遍認為子癇前期的主要發(fā)病機理是血管痙攣和內(nèi)皮活化所致器官灌注減少，其病因可能與母胎免疫失衡、遺傳因素、凝血和纖溶失衡及氧化應(yīng)激等有關(guān)[5]。隨著內(nèi)源性NO在高血壓發(fā)病機理中研究的深入，其在子癇前期發(fā)病機理中的作用越來越受到學(xué)術(shù)界的認可。NO是調(diào)節(jié)血管張力的重要因子，由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，其直接作用于平滑肌擴張血管，降低血管收縮反應(yīng)性。正常妊娠時母體心輸出量增加，血容量增多，心率增快，但血壓卻維持正?；蛏缘停J為NO在很大程度上參與了妊娠期心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。

L-NAME是一種一氧化氮合成酶抑制劑，競爭性抑制體內(nèi)NO的合成。注射L-NAME抑制孕鼠體內(nèi)NO合成可產(chǎn)生類似高血壓癥候群。Sonin等[6]認為，抑制血管內(nèi)皮細胞NO合成使孕鼠血管系統(tǒng)對血管緊張素Ⅱ、去甲腎上腺素等的反應(yīng)性增加而導(dǎo)致血壓升高。蛋白尿是子癇前期的基本特征之一，嚴重患者常伴腎功能損害及腎臟結(jié)構(gòu)的改變[7]。本實驗結(jié)果顯示：注射L-NAM E可導(dǎo)致孕鼠的尿蛋白增加、腎功能損傷、腎小球結(jié)構(gòu)改變、腎小管充滿蛋白管型，這些與人類子癇前期的腎臟病變特點類似[8]。注射L-NAME可使血清ALT和TBIL明顯升高、ALB明顯降低，并伴有肝小葉周邊區(qū)域肝臟局灶性變性壞死，這些特征與人類子癇前期的肝臟病變相符[9]。應(yīng)用L-NAME抑制孕鼠內(nèi)源性NO合成，可使相應(yīng)血管收縮，胎鼠胎盤血液灌注量減少[10]可導(dǎo)致死胎、胎鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩，這是子癇前期的一個重要特征，本實驗研究結(jié)果與Neerhof等[11]的觀點一致。同時，應(yīng)用L-NAME后胎鼠胎盤血液灌注量減少所導(dǎo)致胎盤面積變小、炎性細胞浸潤及纖維素樣壞死、滋養(yǎng)葉細胞增生、出血性梗死等胎盤病理變化，也與人類子癇前期胎盤的病理改變相符。此外，L-NAME還可導(dǎo)致胎鼠發(fā)育畸形，主要表現(xiàn)為后肢短縮畸形。Reyes等[12]認為NO在胎鼠發(fā)育過程中起著重要作用，胎鼠脈管系統(tǒng)NO分泌水平與胎鼠后肢發(fā)育相關(guān)，NO合成減少可導(dǎo)致后肢發(fā)育障礙。該子癇前期動物模型制作方法較國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用的寒冷刺激、雙側(cè)子宮動脈結(jié)扎術(shù)等方法明顯更簡單、重復(fù)性好、成功率高，且更可靠和準確。

綜上所述，注射L-NAME可導(dǎo)致孕鼠產(chǎn)生類似人類子癇前期的表現(xiàn)，而且在病理生理方面也與人類子癇前期極其相似，是一個較為理想的研究子癇前期的動物模型。

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Establishment of rats model of preeclampsia.

LU Min,GONG Hu-ming*,SHI Lei,CHEN Fang-rong.Department ofObstetrics,People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA

Objective To study the cause,pathogenesis,treatment and prevention of preeclampsia,and to establish an ideal animal model of preeclampsia.Methods The pregnant rats were randomly divided into two groups:the control group and preeclampsia group.The pregnant rats of two groups were respectively injected physiological saline and L-NAME after the 12thday of pregnancy,for seven days.Systolic pressure of caudal artery was measured since the tenth day of pregnancy,once per day.The urine protein,liver and kidney function,area of placenta,length and weight of fetus were measured in the two groups.The histological change of placenta and other organs were also observed.Results The systolic pressure of pregnant rats caudal artery slightly decreased along with the progress of pregnancy in the control group.The systolic pressure of caudal artery significantly increased after the thirteenth day of pregnancy in preeclampsia group.The urine protein,changes of liver and kidney function,pathological changes,growth retardation of fetus were observed in preeclampsia group,compared with that in control group.Conclusion L-NAME can induce the manifestation of preeclampsia in pregnant rats,which is extremely similar with preeclampsia of human in the aspects of pathophysiology,and thus provide an ideal method to establish an animal model of preeclampsia.

Rats;L-NAME;Preeclampsia;Systolic pressure

R-332

A

1003—6350（2012）16—021—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.16.008

海南省自然科學(xué)基金(編號：瓊科30636)

盧 敏(1978—)，女，海南省瓊海市人，副主任醫(yī)師，碩士。*

龔護民(1972—)。E-mail：Gonghm2000@hotmail.com

2012-02-29)