宋仁剛

血管生成素相關(guān)蛋白(ANGPTL-1)是新發(fā)現(xiàn)的一種與血管生成、脂類代謝、糖代謝和胰島素敏感性密切相關(guān)的分泌型糖蛋白，該家族已發(fā)現(xiàn)ANGPTL-1～7。ANGPTL-1與血管生成素的結(jié)構(gòu)相似，屬于纖維蛋白原家族。然而，ANGPTL-1不能與Tie－2受體結(jié)合，因此不是真正意義上的血管生成素，故命名為血管生成素樣蛋白(ANGPTL-1)[1-3]。我們的前期研究表明，ANGPTL－1基因在青年小鼠尾部皮膚中的表達(dá)明顯高于老年小鼠[4-5]。為進(jìn)一步研究ANGPTL－1基因在皮膚細(xì)胞中的作用，本實(shí)驗(yàn)以人皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染ANGPTL－1基因，探討ANGPTL－1轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞的可行性，及轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞增殖速率和Ⅰ、Ⅲ型膠原合成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌top10，高效真核表達(dá)載體pcDNA3.0(Invitrogen公司，美國(guó))，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Gibco 公司，美國(guó)），胎牛血清（FBS，Hyclone 公司,美國(guó)），膠原酶NB4（Serva公司，德國(guó)）,脂質(zhì)體Lipofectamine 2000（Invitrogen 公司，美國(guó)），PCR 引物由上海生物工程公司合成，TRIzol RNA抽提試劑盒（Gibco公司，美國(guó)），RT-PCR 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa 公司，日本），GeneRulerTM1 kb DNA Ladder（Fermentas公司，立陶宛）。 激光共聚焦顯微鏡（Leica 公司，德國(guó)），ABI 7300 Real-time PCR擴(kuò)增儀（ABI公司，美國(guó)），GIS22800型凝膠圖像處理系統(tǒng)（上海天能科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 ANGPTL－1真核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

目的基因ANGPTL－1 cDNA片段由RT-PCR方法獲取。PCR擴(kuò)增引物Full length-F:5'－AGCAGGCAGTCAGAGTGGG－3'，F(xiàn)ull length-R:5'－TGGAAGGAAGAGCCGAGAC－3'；PCR 條件為：模板 2μL，PCR 緩沖液 5μL，上游引物 1μL，下游引物1μL，TaqDNA 聚合酶 1μL，dNT4μL，H2O 36μL。94 ℃ 4min，然后 94 ℃ 30 sec、68 ℃ 2.5min（35個(gè)循環(huán)），再68℃延伸10min，產(chǎn)物長(zhǎng)度3123 bp。PCR純化產(chǎn)物裝入克隆載體PMD 18-T，大腸桿菌top10在LB固體培養(yǎng)皿上涂片培養(yǎng),經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取單個(gè)白色菌落在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中擴(kuò)增。用HindⅢ和XbaI雙酶切TA載體回收目的片段，表達(dá)載體pcDNA3.0用HindⅢ和XbaI雙酶切回收線性載體，兩者用T4連接酶連接，構(gòu)建pcDNA-ANGPTL-1，經(jīng)酶切電泳鑒定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

皮膚標(biāo)本來源于深圳市人民醫(yī)院門診患者，無菌條件下切取標(biāo)本，以0.5%氯霉素沖洗標(biāo)本并浸泡10min，將標(biāo)本剪碎至1～2 mm3大小，0.3%NB4復(fù)合膠原酶，37℃搖床消化3 h，150目濾網(wǎng)收集過濾液，1500 r/min離心 10min，收集細(xì)胞，按 2×104個(gè)/cm2接種于培養(yǎng)皿，24h后首次換液。準(zhǔn)備傳代，轉(zhuǎn)染。分組：未轉(zhuǎn)染正常組、轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.0組和pcDNA3.0-ANGPTL-1轉(zhuǎn)染組。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24h，按2×105個(gè)/孔接種于6孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)至30%～45%融合時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。方法：取無血清 DMEM 培養(yǎng)液 240μL與 10μL Lipofectamine 2000混勻，另取 240μL DMEM 培養(yǎng)液與 10μL（100 pmol）質(zhì)?；靹颍?min后分別合并脂質(zhì)體和質(zhì)粒兩液，室溫放置20min。吸掉培養(yǎng)液，以1.5 mL/孔加純DMEM培養(yǎng)基，再加入脂質(zhì)體質(zhì)粒液，37℃培養(yǎng)5 h后，棄轉(zhuǎn)染液，換10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.4 Real－time PCR 檢測(cè)

分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的未轉(zhuǎn)染正常組細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.0和ANGPTL-1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞，用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量后，行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT）。取總 RNA 1 μg，oligo dT 1μL（0.5 μg）， 補(bǔ)足 DEPC 處理的 ddH2O 至 13μL，65℃變性5min，立即置冰浴，加RNase抑制劑20 U，2.5 mmol/L dNTP 1μL，5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 4μL，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 200 U 2μL，總體積 20μL。 反應(yīng)程序：25 ℃ 15min，37 ℃反應(yīng) 1 h，95 ℃ 5min。終止反應(yīng)后，RT產(chǎn)物行Real-time PCR法檢測(cè)NOS、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)。根據(jù)人ANGPTL-1基因及Ⅰ、Ⅲ型膠原基因序列，設(shè)計(jì)上、下游引物序列。ANGPTL-1-F：5'-TTCTACAGAGGCTCGTGGCT-3'，ANGPTL-1-R：5'-GTATCATGAGTACCCGGTGT-3'；Col-Ⅰ-F：5'-GAACGCGTGTCATCCCTTGT-3'，Col-Ⅰ -R：5'-GAACGAGGTAGTCTTTCAGCAACA-3'；Col-Ⅲ-F：5'-AACACGCAAGGCTGTGAGACT-3'，Col- Ⅲ -R：5'-GCCAACGTCCACACCAAATT-3'。RT產(chǎn)物稀釋10倍后取1μL作為模板 ，加入2×SYBR Premix Ex TaqTM12.5μL，上游引物、下游引物（10 pmol）各1μL， ddH2O 補(bǔ)足體積到 25μL。反應(yīng)條件：50℃ 2min，95℃變性 15min后，95℃15 sec，60 ℃ 1min，40 個(gè)循環(huán)。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

當(dāng)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，收集、離心，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cells/mL，上樣，行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 ANGPTL－1基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

利用RT-PCR成功擴(kuò)增了ANGPTL-1基因全長(zhǎng)，約3.3 Kb。載體在2%瓊脂糖凝膠中可見約8.4 Kb DNA帶，與預(yù)期質(zhì)粒大小結(jié)果相一致，用HindⅢ和XbaI雙酶切電泳，在同一泳道中出現(xiàn)2條DNA帶，1條5.5 Kb，與空質(zhì)粒DNA鏈長(zhǎng)度一致，確定為質(zhì)粒 DNA帶；另 1條 3.1 Kb，與 ANGPTL-1 cDNA片段大小一致。基因測(cè)序后，證實(shí)所合成基因序列與基因庫(kù)中一致率為99.95%。

2.2 人皮膚成纖維細(xì)胞ANGPTL－1轉(zhuǎn)染率

流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示，人皮膚成纖維細(xì)胞被轉(zhuǎn)染48 h后，（63±7.1）%的被轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)報(bào)告基因熒光（圖 1）。

圖1 人皮膚成纖維細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染ANGPTL-1，細(xì)胞內(nèi)可見綠色熒光表達(dá)Fig.1 Observation of GFP reporter gene vector.Green fluorecence can be seen in the hypertrophic scar fibroblasts after target cells were transfected

2.3 RT-PCR檢測(cè) ANGPTL－1 mRNA表達(dá)

轉(zhuǎn)染24h后，Real-time PCR檢測(cè)到ANGPTL-1 mRNA在轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的表達(dá)分別為（5.24±1.16）、（1.71±0.32）和（1.89±0.19），轉(zhuǎn)染組的相對(duì)表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組明顯增高（P<0.01，n＝5）；未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05，n＝5）（圖 2）。

圖2 ANGPTL-1 mRNA的表達(dá)Fig.2 The relative expression of ANGPTL-1 mRNA

2.4 ANGPTL－1轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞 Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的影響

Ⅰ、Ⅲ型膠原 mRNA在轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空載體組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的表達(dá)分別為（3.33±0.53）與（2.09±0.26）、（0.91±0.19）與（0.93±0.26）和（0.94±0.14）與（0.95±0.22）。轉(zhuǎn)染組的相對(duì)表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體組均明顯增高（P<0.01，n＝5）（圖 3）。

圖3 Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)Fig.3 Expression of collagenⅠ,Ⅲ mRNA

3 討論

關(guān)于ANGPTL-1基因作用的研究，目前主要集中在血管發(fā)生、內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)及胚胎器官發(fā)生等方面，其他方面較少涉及。根據(jù)基因芯片數(shù)據(jù)分析，ANGPTL-1基因在青年小鼠與老年小鼠尾部皮膚中表達(dá)差異顯著[4-5]。此外，我們的前期研究中還發(fā)現(xiàn)，ANGPTL-1基因的表達(dá)與Ⅰ、Ⅲ型膠原基因的表達(dá)呈相關(guān)性。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了先構(gòu)建ANGPTL-1基因再進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染的研究方案，并采用真核表達(dá)載體，保證了研究結(jié)果的可靠性。

重組的ANGPTL-1基因轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染的ANGPTL-1轉(zhuǎn)錄因子能否有效表達(dá)，是判斷轉(zhuǎn)染成功與否的關(guān)鍵。我們采用流式細(xì)胞儀觀察與相對(duì)精確的Real-time PCR方法相結(jié)合[6-7]，發(fā)現(xiàn)（63±7.1）%的細(xì)胞表達(dá)報(bào)告基因，而且轉(zhuǎn)染組表達(dá)明顯高于對(duì)照組。提示ANGPTL-1基因已成功轉(zhuǎn)入人皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)。

膠原蛋白是人體真皮組織中的重要組成部分，隨著紫外線的不斷照射以及人年齡的增加，皮膚內(nèi)透明質(zhì)酸與膠原蛋白的含量逐漸減低，真皮組織被氧化、皮膚塌陷、萎縮。皮膚表現(xiàn)為粗糙、干燥、皺紋增大、松弛等一系列衰老征象[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA合成增加。ANGPTL-1表達(dá)增強(qiáng)可導(dǎo)致皮膚成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)加強(qiáng)。進(jìn)而提示我們，控制ANGPTL-1的過度表達(dá)有可能控制皮膚成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)皮膚的老化。

綜上所述，我們證實(shí)皮膚成纖維細(xì)胞可作為ANGPTL-1轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞；通過調(diào)節(jié)ANGPTL-1基因，可調(diào)節(jié)皮膚中膠原含量，起到延緩衰老的作用。

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