成永霞 劉貴波 顏彬 郭素芬 馮玉寬 陳麗麗 曹永 王宏偉 孫立新 李志強

近年來，糖尿病發(fā)病率呈上升趨勢，我國糖尿病患者達9240萬例，糖尿病前期患者高達1.48億[1]。糖尿病心肌?。―iabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病心肌損害的特異性表現(xiàn)，與糖尿病患者心力衰竭高發(fā)生率和高死亡率密切相關，病理表現(xiàn)為心肌肥大，心室重量/體重比（心臟重量指數(shù)）增加，局灶性心肌壞死和心肌纖維化等[2]。高血糖狀態(tài)可通過各種機制導致血管內皮細胞損傷，同時，氧化應激及過氧化物產生過量與糖尿病心肌病發(fā)展密切相關，本實驗擬探討內皮祖細胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）對糖尿病心肌病的治療作用，及其對機體氧化應激的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用清潔級SD大鼠（中國醫(yī)科大學實驗動物中心）；鏈脲佐菌素（STZ，Sigma 公司）；EPCs細胞（本實驗室分離培養(yǎng)）；M199培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone 公司）；VEGF、FGF、EGF（PeproTech 公司）；eNOS、iNOS 抗體（Abcam 公司）；谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病心肌病大鼠模型的建立及內皮祖細胞治療

EPCs 培養(yǎng)于含有 VEGF 10 μg/L、FGF 4 μg/L、EGF 3 μg/L、10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基中。24只SD大鼠隨機分為3組：對照組（A），糖尿病心肌病模型組（B），EPCs治療組（C），每組 8 只。 參照文獻[3]建立大鼠糖尿病心肌病模型，即高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周后，一次性空腹注射STZ 60 mg/Kg，選擇連續(xù)兩次空腹血糖大于7.77 mmol/L，且有多飲、多食、多尿癥狀的大鼠進行后續(xù)實驗。C組于STZ注射8周后于尾靜脈注射 EPCs 1×106個（500μL）。A、B 兩組注射等體積生理鹽水，8周后進行生化指標檢測。

1.2.2 大鼠心肌組織形態(tài)學觀察及血糖水平、血清GSH、MDA含量檢測

取各組大鼠心肌組織行HE染色，觀察各組心肌組織的形態(tài)學改變；采用葡萄糖氧化酶法進行空腹血糖（FBG）測定；采用GSH測定試劑盒和MDA測定試劑盒檢測各組大鼠血清中GSH和MDA含量。

1.2.3 RT-PCR檢測心肌組織中iNOS和eNOS的mRNA表達水平

取各組大鼠心肌組織，提取樣本總RNA，逆轉錄得到對應的cDNA，進行PCR檢測。引物如下。

iNOS sense：5'-TCTCCCGAAACGCTACACTT-3'；antisense:5'-CGTCTGGCGAAGAACAATC-3'； 產物 長 度 317 bp。 eNOS sense：5'-ATGTATGGCTCT GAGACTGGC-3'；antisense：5'-GGGTTACCACATCGTATTCATC-3'； 產物長度 115 bp；β-actin sense:5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC -3'，antisense:5'-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3'；產物長度155 bp。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR擴增條件：95℃ 90 sec預變性，94℃ 45 sec變性，55℃ 45 sec退火，72℃ 90 sec復性，25個循環(huán)后，72℃10min延伸。β-actin作為內對照。

1.2.4 Western blot檢測心肌組織中iNOS和eNOS的蛋白表達水平

取各組大鼠心肌組織，RIPA裂解液裂解組織，BCA法進行蛋白質濃度測定，取20 μg等量蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），免疫印跡法檢測iNOS和eNOS蛋白表達變化。

1.2.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌組織形態(tài)學觀察

A組心肌細胞排列整齊，B組表現(xiàn)為心肌肥大、心肌細胞排列紊亂，C組心肌細胞排列較整齊，與正常組近似（圖1）。

2.2 各組大鼠血糖、GSH和MDA含量檢測

與A組相比，B組大鼠血糖顯著增高（P<0.01），是A組的6.04倍；C組血糖明顯低于B組（P<0.01），但仍高于A組（P<0.01）；同時，B組大鼠血清GSH含量顯著降低（P<0.01），MDA 含量顯著升高（P<0.01）；與 B組相比，C組GSH含量顯著升高（P<0.01），MDA含量明顯降低（P<0.01），表明EPCs可以緩解糖尿病心肌病導致的脂質過氧化作用（表1）。

2.3 大鼠心肌組織中iNOS和eNOS的mRNA表達

RT-PCR結果顯示，B組中iNOS和 eNOS的mRNA表達均顯著升高（P<0.01），C組明顯低于B組（P<0.05）。

2.4 大鼠心肌組織中iNOS和eNOS蛋白表達水平

各組大鼠心肌組織中iNOS和eNOS蛋白的表達情況與RT-PCR結果一致。B組表達顯著升高（P<0.05），C 組明顯低于 B 組（P<0.05）。

圖1 大鼠心肌組織形態(tài)學觀察Fig.1 Morphological observation of myocardial tissue in rat

表1 各組大鼠血糖、GSH和MDA含量比較Table 1 Comparison of the blood glucose GSH and MDA content of different rat groups

圖2 大鼠心肌組織中iNOS和eNOS mRNA的表達比較Fig.2 Comparison of iNOS and eNOS mRNA expression in myocardial tissue of rats

圖3 大鼠心肌組織中iNOS蛋白表達比較Fig.3 Comparison of iNOS protein expression in myocardial tissue of rats

圖4 大鼠心肌組織中eNOS蛋白表達比較Fig.4 Comparison of eNOS protein expression in myocardial tissue of rats

3 討論

本研究采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)合并STZ誘導的方法，建立大鼠糖尿病模型。此方法能夠模擬臨床2型糖尿病患者，并且具有建模周期短、死亡率低等優(yōu)點[4]，被廣泛應用于糖尿病相關的實驗研究。本實驗所建立的大鼠模型具有穩(wěn)定的高血糖和高血脂表現(xiàn)。HE染色顯示，B組心肌細胞肥大且排列紊亂，表明已成功建立了大鼠DCM模型。

內皮組細胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）是血管內皮細胞的前體細胞，能夠參與血管內皮修復以及血管新生。研究表明，糖尿病患者EPCs數(shù)量明顯減少，且血管功能發(fā)生病理性改變[5]，Loomans等[6]認為，糖尿病患者EPCs的數(shù)量和增殖能力與空腹血糖、糖化血紅蛋白水平呈顯著負相關。胰島素抵抗（IR）是2型糖尿病最重要的病理生理學特征。相關研究表明，血管內皮功能障礙與IR密切相關[7-8]。本研究中，C組血糖水平較B組顯著降低，可能是血管內皮功能的修復改善了胰島素抵抗狀態(tài)。

DCM是糖尿病患者的一種特異性心肌疾病，隨著糖尿病發(fā)病率的逐年增高和病程的延長，DCM成為糖尿病患者死亡的主要原因之一[9]。DCM的發(fā)病機制尚未明確。有研究表明，高血糖導致的氧化應激能夠引起心肌功能障礙，并參與DCM發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)[10]。MDA是脂質過氧化反應的高毒性副產物，能夠反映體內脂質過氧化損傷的程度及氧化應激的水平。GSH為體內重要的抗氧化劑和自由基清除劑，可阻斷氧自由基對心肌的損害，預防、減輕及終止組織細胞損傷，在保護心肌細胞方面具有良好的作用[11-12]。本研究結果提示，B組大鼠血清MDA含量明顯升高，GSH含量顯著降低，表明機體中存在著一定的氧化損傷；采用EPCs治療后，MDA含量顯著降低，GSH含量顯著回升，提示機體氧化應激損傷得到緩解。

機體的氧化應激作用可形成過多的超氧離子，超氧離子與NO相互作用能夠形成潛在的細胞毒性物質，導致心血管功能的紊亂。正常情況下，心肌細胞能夠合成少量NO維持生理功能，當受到外界刺激后，導致一氧化氮合酶（NOS）表達增加，從而產生大量的NO參與病理過程[13]。Crespo等[14]在STZ誘導的糖尿病心肌病大鼠模型中，檢測到超氧化物含量的增加以及eNOS、iNOS的顯著升高，表明eNOS和iNOS活性的升高與心臟功能的下降密切相關，推測心臟氧化應激可能是STZ誘導的糖尿病心肌病的主要病因。本研究中，B組大鼠心肌組織中eNOS和iNOS的表達均顯著升高，與已有的報道一致[15]，而C組eNOS、iNOS表達顯著降低，提示EPCs具有緩解心肌損傷的作用。

DCM主要是由糖尿病引起的心臟微血管病變和心肌代謝紊亂所致的心肌局灶性壞死。研究表明，EPCs具有促進缺血組織新生血管形成的作用[16-17]，將EPCs注射入大鼠心肌梗死灶邊緣，能夠顯著提高心室射血分數(shù)和左心室短軸縮短率，表明EPCs能夠改善心肌功能[18]。本研究表明，EPCs能夠有效緩解DCM大鼠機體的氧化應激反應，降低NOS水平，恢復受損的心肌組織。我們推測可能與心肌血管生成，以及心肌功能的改善有關，但其詳細的作用機理還有待于進一步研究。

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