曹小芳 王恒湘 何梓銘 王芳 楊洋 郭子寬

（何梓銘，王芳，楊洋，郭子寬）。

高遷移率族蛋白（High mobility group box 1，HMGB1）是廣泛存在于真核生物細胞核內(nèi)的染色體結(jié)合蛋白，也存在于細胞質(zhì)和細胞外，具有多種生理和病理學(xué)作用，主要由A-box、B-box及酸性尾端3個結(jié)構(gòu)域組成[1]。HMGB1與炎細胞表面的RAGE受體、TLR22和TLR24等受體相互作用后可引起細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化,釋放炎性因子[2]。細胞壞死或損傷時,在腫瘤壞死因子的作用下，細胞核內(nèi)的HMGB1可釋放到胞外,刺激單核巨噬細胞分泌促炎因子，促炎因子又可促進HMGB1的分泌，形成正反饋環(huán)。在炎性反應(yīng)的后期，這種正反饋效應(yīng)對RA等疾病炎性反應(yīng)的維持具有重要的作用[3-4]。間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSC）是一類具有多向分化能力的成體干細胞，在適宜的條件下，可以分化為成骨細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞、血管內(nèi)皮細胞、肝臟細胞、神經(jīng)細胞和心肌細胞等[5]。值得關(guān)注的是，間充質(zhì)干細胞所處的微環(huán)境可能對其生物學(xué)特性產(chǎn)生相應(yīng)的影響，賦予其獨立的特征。然而，HMGB-1 A-box對MSC的作用研究甚少。為探討HMGB1A-box是否具有促成骨作用，我們進行了其表達載體構(gòu)建、重組蛋白純化和生物學(xué)活性的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

pGEM-T Easy Vector Systems購于Promega公司；pET24a HMGB1基因由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；E.coli DH5α 和 BL21 PlySs（DE3）大腸桿菌感受態(tài)購于北京Transgen公司；人骨髓間充質(zhì)干細胞由本室保存；測序公司為北京奧克生物技術(shù)公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購于北京天根生物公司；限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoⅠ購于Promega公司；蛋白定量試劑盒購于申能博彩生物技術(shù)有限公司；小鼠源HMGB1抗體為sigma產(chǎn)品；HRP2羊抗鼠2IgG購于Millipore公司；DNA marker購于天根生物技術(shù)公司；蛋白Marker購于上海生物工程有限公司；誘導(dǎo)劑IPTG為BBI產(chǎn)品；Western blot化學(xué)發(fā)光底物為Santa Cruz產(chǎn)品；α-MEM培養(yǎng)基購于Sigma公司；胎牛血清購于Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)HMGB1基因序列，設(shè)計HMGB1 A-box上、下游特異性引物：5′-CAAATGGGTCGCGGATCCGAATTC-3′（劃 線處 為 BamHI 酶 切 位 點 ）；5′-AAAAAGCTCGAGCACCACCACCACC-3′（劃線處為XhoⅠ酶切位點）。上述引物均由北京奧克生物技術(shù)公司合成。

1.2.2 重組DNA技術(shù)

以質(zhì)粒pET24a HMGB1為模板擴增目的基因，PCR回收產(chǎn)物與pGEM-T Easy Vector載體按摩爾數(shù)4:1的比例加入反應(yīng)體系，室溫連接4h后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)。轉(zhuǎn)化完成后，將菌液涂布于Amp+的LB瓊脂板（先將5μL 1M 的IPTG 和20μL 50 mg/mL的X-gal涂布于瓊脂板上）上，菌液體積要有一定梯度。將涂布好的瓊脂板倒置于37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12～16 h，至平板上出現(xiàn)可辯的藍、白菌落，將白色菌落標(biāo)號，提質(zhì)粒行酶切鑒定和DNA測序鑒定重組子。重組pGEM-T AboxA-box經(jīng)BamHI、XhoⅠ雙酶切分離目的基因片段，插入表達載體HIS-tag的相應(yīng)位點。陽性克隆擴菌，保存菌種并提取質(zhì)粒備用。

1.2.3 重組蛋白的表達

經(jīng)鑒定的陽性重組表達載體pET24a+轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)菌株，挑取單個克隆菌落擴增培養(yǎng)至對數(shù)生長期。加入誘導(dǎo)劑IPTG，終濃度為1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)4h。細菌裂解物行SDS-PAGE電泳，凝膠圖像拍照記錄，分析目的蛋白表達水平。

1.2.4 包涵體的制備、蛋白純化和驗證

重組菌株擴菌,超聲破碎。離心收取沉淀(包涵體)。按照 MagneHISTM Protein purification system cat說明書裂解包涵體。重組菌株的超聲上清與His-Link親和層析柱4℃充分結(jié)合3 h，將親和層析柱連于HID-2核酸檢測儀，洗滌和洗脫獲得純化的重組蛋白，透析去除洗脫液中的咪唑等小分子物質(zhì)。SDS-PAGE檢測蛋白純度。用小鼠源HMGB1單抗和辣根過氧化酶標(biāo)記的抗小鼠二抗行Western blot，鑒定重組蛋白。

1.2.5 重組蛋白的生物學(xué)活性測定

收獲傳代3次的hBMSC，懸浮于含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中，按12000個細胞/孔接種于24孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)體系分為：①陰性對照組，培養(yǎng)體系為含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基；②陽性對照組，培養(yǎng)體系中加入50 μg/mL維生素C磷酸鹽，10 mM的磷酸甘油鈉鹽，10-7M地塞米松鈉鹽；③A-box組，體系中加入A-box，濃度分別為6.25 μg/mL，12.5 μg/mL，25 μg/mL 和 50 μg/mL。每組4孔。3次實驗使用細胞來源于3個不同個體。培養(yǎng)1周后，吸除培養(yǎng)上清，1%多聚甲醛固定后，NBT/BCIP試劑進行堿性磷酸酶染色，倒置顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 重組表達載體的構(gòu)建

以pET24a HMGB1為模板,行PCR擴增。 瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增的基因片段約250 bp,與目的基因片段大小相符(圖1)。

圖1 PCR結(jié)果顯示A-box目的片段Fig.1 Human HMGB1 A-box showed by DNA sequencing

圖2 pGEM-T A-box質(zhì)粒酶經(jīng)BamHI和XhoⅠ酶切后瓊脂糖電泳結(jié)果。1，3，5道分別代表不同細菌克隆的質(zhì)粒；2，4，6道分別代表相應(yīng)質(zhì)粒酶切后電泳結(jié)果；7道是DNA分子標(biāo)準物Fig.2 The targeted cDNA fragment separated by agarose gel electrophoresis after enzyme digestion by BamH I and Xho I.1,3,5:different recombinant vector;2,4,6:different recombinant vector after enzyme digestion;7:DNA marker

將目的片段插入克隆載體pGEM-T,挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒并進行BamH I和XhoⅠ雙酶切鑒定，證實克隆片段大小為250 bp（圖2），符合預(yù)期結(jié)果。將質(zhì)粒DNA回收，進行質(zhì)粒DNA序列測定，測序結(jié)果與Genebank所記載的序列完全相符。

將克隆載體質(zhì)粒用BamHI和XhoⅠ消化，純化目的片段并將之插入原核表達載體pET24a+的HIS-tag相應(yīng)位點，酶切驗證所插入片段為250 bp左右（圖3），與目的條帶大小相符合，證實獲得了人HMGB1 A-box的重組表達載體。

圖3 pET24a+/A-box酶切鑒定結(jié)果。1，3代表雙酶切結(jié)果；2，4代表質(zhì)粒；5代表DNA分子標(biāo)準物Fig.3 The targeted cDNA fragment after enzyme digestion by pET24a+/A-box.1,3:recombinant vector after enzyme digestion;2,4:recombinant vector;5:DNA marker

2.2 重組蛋白的表達

陽性重組菌株誘導(dǎo)前、后和含有pET24a+/A-box菌株裂解液均行SDS-PAGE。誘導(dǎo)后裂解pET24a+/A-box陽性重組菌株，電泳證實在相對分子質(zhì)量約為11000處可見一明顯蛋白條帶,與預(yù)期蛋白大小相符(圖4)。目的蛋白質(zhì)總量約為菌體總量的45%。

圖4 轉(zhuǎn)染的陽性細菌目的蛋白表達情況。1-3分別代表：蛋白質(zhì)分子標(biāo)記物，IPTG誘導(dǎo)的菌體裂解液，未誘導(dǎo)的菌體裂解液。箭頭所指為目的蛋白大小Fig.4 A-box expression after transfection.1:marker;2:bacterium spallation induced by IPTG;3:un-induced bacterium spallation;arrow:the targeted protein

2.3 重組蛋白的純化

將重組菌體擴增后，IPTG誘導(dǎo)表達。收集菌體，超聲破碎包涵體，收獲裂解上清，行His柱親和層析，并收獲目的蛋白。SDS-PAGE電泳顯示，經(jīng)純化后，未見雜蛋白條帶，表明收獲蛋白純度較高（圖5）。

用小鼠源HMGB1單抗和辣根過氧化酶標(biāo)記的抗小鼠的二抗行Western blot，以HMGB-1蛋白分子為陽性對照，以鑒定重組蛋白。結(jié)果兩者均能與抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，表明重組蛋白為特異性人HMGB1 A-box蛋白（圖 6）。

2.4 重組蛋白的生物學(xué)活性

我們的前期實驗表明，HMGB1能誘導(dǎo)hBMSC向成骨細胞分化[6]。鑒于A-box是HMGB1分子的受體結(jié)合區(qū)，A-box可能具有相似的作用。實驗表明，hBMSC培養(yǎng)體系中加入A-box，1周后進行堿性磷酸酶染色發(fā)現(xiàn)，隨著A-box濃度增加，細胞染色逐漸變強，甚至較陽性對照孔細胞深。因此，A-box具有明顯的促MSC分化為成骨細胞的作用（圖7）。

圖5 經(jīng)純化后蛋白電泳圖。1-3：包涵體裂解物經(jīng)純化后，上清經(jīng)純化后，蛋白質(zhì)分子標(biāo)準物。箭頭為目的蛋白大小Fig.5 A-box expression after purification.1:inclusion lysate after purification;2:supernatant after purification;3:marker;arrow:the targeted protein

圖6 Western blot結(jié)果。以HMGB1蛋白為陽性對照，證實所純化蛋白為A-boxFig.6 A-box expression tested by western blot and HMGB1 was taken as positive control

圖7 A-box體外促MSC成骨分化作用。將人MSC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的低糖DMEM（A），或在體系中加入成骨誘導(dǎo)劑組合（B），A-box（6.25 μg/mL）（C），A-box（12.5 μg/mL）（D），A-box（25 μg/mL）（E）和 A-box（50μg/ml）（F）。 NBT/BCIP染色顯示堿性磷酸酶陽性細胞（成骨細胞）Fig.7 The induction-promoting effects on mesenchymal stem cells of A-box in vitro.A:normal medium;B:ossification revulsant added medium;C:6.25 μg/mL A-box added medium;D:12.5 μg/mL A-box added medium;E:25 μg/mL A-box added medium;F:50 μg/mL A-box added medium

3 討論

HMGB 1含215個氨基酸殘基,是高遷移率族蛋白的超家族成員之一。HMGB1是一個炎性因子，在自身免疫性疾病和膿毒血癥等疾病發(fā)生發(fā)展中，起著十分重要的作用[7]。此外，間充質(zhì)干細胞表達相關(guān)受體，可受HMGB-1趨化而遷徙至炎性組織，并在其作用下分化為成骨細胞[6]。因此，HMGB-1也可能參與了某些骨關(guān)節(jié)疾病的發(fā)病過程[8]。

HMGB1含有兩個結(jié)構(gòu)區(qū)域，稱為A-box和B-box。其中，A-box是HMGB1細胞受體結(jié)合區(qū)域，B-box為效應(yīng)區(qū)域。因此，體系中加入A-box單體，可競爭阻斷HMGB1與受體的結(jié)合，從而抑制HMGB1引起的炎癥反應(yīng)。因此，A-box單體作為HMGB1拮抗劑，有可能用于自身免疫性疾病和敗血癥的治療[9-11]。文獻報道，HMGB1是重要的炎癥因子，廣泛參與各種急、慢性炎癥過程，并在疾病的轉(zhuǎn)歸中起關(guān)鍵作用[11]。因而，以HMG蛋白作為藥物治療的靶點在炎癥性疾病的研究中具有重要意義[10-11]。

我們的研究證實，A-box單體與HMGB-1類似，可促進MSC向成骨細胞分化，這種作用呈現(xiàn)劑量依賴性。A-box的作用具有雙重性，即抗炎性反應(yīng)和促成骨分化作用，為其在多種疾病中的應(yīng)用提供了獨特的可行性。如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，它是一種由免疫反應(yīng)介導(dǎo)的關(guān)節(jié)局部炎性反應(yīng)，在疾病后期，常出現(xiàn)骨蝕等骨關(guān)節(jié)損傷。因此，結(jié)合本實驗結(jié)果可以推測，利用A-box單體治療，可以通過阻斷HMGB-1的活性，以抑制骨關(guān)節(jié)局部的炎性反應(yīng)；而且，可以通過促成骨作用，加速骨組織損傷的修復(fù)。再如，骨折后骨不連同時存在炎性反應(yīng)和骨修復(fù)障礙。A-box單體的雙重作用，在促進局部MSC分化為成骨細胞的同時，拮抗由組織壞死引起的炎性反應(yīng)，可能適用于此類疾病的治療。然而，A-box能否真正應(yīng)用于上述疾病，具體的應(yīng)用途徑和劑量，以及A-box單體是否具有其它生物學(xué)效應(yīng)，仍需大量研究探討。

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