高 峰，陳世玖，張麗杰，倪少俊，楊 軍，李 智

(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院手外、整形科，廣東珠海519100)

指甲再生來(lái)源于甲根和甲弧影下方的甲床，此處的甲床稱為甲母質(zhì)。甲床提供指甲向遠(yuǎn)端生長(zhǎng)的滑面，當(dāng)甲床受損后，新生的指甲會(huì)出現(xiàn)不整齊現(xiàn)象而影響美觀。因此，臨床工作者們不懈地努力研究，不同類(lèi)型的甲床損傷采用何種方式修復(fù)，術(shù)后能達(dá)到理想的效果。隨著顯微技術(shù)的發(fā)展，可根據(jù)情況選擇不同的方法，完善了甲床損傷的治療，如游離甲床移植術(shù)、皮瓣修復(fù)術(shù)、游離甲瓣修復(fù)術(shù)等。近些年，對(duì)甲床基礎(chǔ)的研究相對(duì)較少，本實(shí)驗(yàn)旨在為深入研究甲床細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 甲床上皮細(xì)胞組織塊

培養(yǎng) 收集一名臨床志愿者因經(jīng)專(zhuān)科醫(yī)師檢查及超聲波檢查后發(fā)現(xiàn)胎兒死在宮內(nèi)，進(jìn)行立即引產(chǎn)，取得胎兒手指(經(jīng)本人和家屬知情同意)。將20周以上胎兒手指放入70%乙醇中浸泡5 min，取出后用磷酸鹽緩沖液沖洗3遍。超凈工作臺(tái)內(nèi)4倍手術(shù)放大鏡下，切取甲床，放入含雙抗的磷酸鹽緩沖液中備用。將切取的甲床組織在培養(yǎng)皿內(nèi)用眼科剪將其剪切成1 mm2的小塊，均勻地平鋪于25 cm2培養(yǎng)瓶底部，組織塊與組織塊之間保持0.5 cm左右的距離，加入無(wú)血清角化細(xì)胞培養(yǎng)基，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～4 h，待組織塊黏著牢固時(shí)，加入0.001～0.002 L培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液慢慢浸潤(rùn)組織塊，再輕輕且緩慢翻轉(zhuǎn)正置培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)基剛好浸過(guò)組織塊平面，以不令組織塊漂起為標(biāo)準(zhǔn)。再于37℃ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24～48 h后補(bǔ)加培養(yǎng)液0.002～0.003 L，培養(yǎng)的前2 d應(yīng)避免過(guò)多觀察和晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，以防組織塊脫壁。以后每天觀察組織塊的變化，21 d仍無(wú)細(xì)胞生長(zhǎng)者予以淘汰。

1.2 甲床成纖維細(xì)胞組織塊培養(yǎng) 收集、獲得組織塊及培養(yǎng)方法同1.1段所述。采用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.3 細(xì)胞鑒定 甲床上皮細(xì)胞檢測(cè)角蛋白17，免疫組織化學(xué)染色法，按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。成纖維細(xì)胞免疫熒光顯微鏡檢測(cè)波形蛋白表達(dá)方法按公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)并按參考文獻(xiàn)［1］進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 甲床細(xì)胞生長(zhǎng)情況

2.1.1 甲床上皮細(xì)胞 倒置顯微鏡觀察，2～3 d左右從組織塊中游出，并在組織塊周?chē)纬缮L(zhǎng)暈，能游出細(xì)胞的組織塊占貼附組織塊的比例約1/3，13 d左右細(xì)胞生長(zhǎng)密度可達(dá)瓶底的70%～80%，扁圓形或多角形細(xì)胞，呈鋪路石樣排列，其數(shù)目可達(dá)1×1010～1 ×1011個(gè)/L。

2.1.2 甲床成纖維細(xì)胞 2 d可見(jiàn)組織塊周?chē)械募?xì)胞游離出來(lái)，呈放射狀，3 d觀察可見(jiàn)組織塊周?chē)性S多生長(zhǎng)的細(xì)胞，呈圓梭形、長(zhǎng)梭形、多角形等成纖維細(xì)胞的特征，胞體豐富，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，11 d左右細(xì)胞生長(zhǎng)密度可達(dá)瓶底的70%～80%。其數(shù)目可達(dá)1×1010～1×1011個(gè)/L。

2.2 甲床細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 培養(yǎng)的甲床上皮細(xì)胞70%以上特異性角蛋白17抗體染色陽(yáng)性，證明培養(yǎng)的細(xì)胞為甲床上皮細(xì)胞;培養(yǎng)的甲床成纖維細(xì)胞抗波形蛋白抗體染色陽(yáng)性，說(shuō)明培養(yǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。

3 討論

指(趾)甲和甲床作為皮膚的附屬組織，具有與皮膚不同的組織結(jié)構(gòu)，并由此具有特殊的功能，如對(duì)指功能和美容作用等。指(趾)甲由外胚層分化而來(lái)。第13周時(shí)，發(fā)育中的甲單位的上皮能夠分成四層:基底層、棘細(xì)胞層、顆粒層和角質(zhì)層，被稱為甲床上皮。在20周時(shí)甲板完全覆蓋甲床，并且甲床上皮完全失去顆粒層，此時(shí)，胎兒的甲與成人的甲基本相似。所以，本研究選擇此時(shí)期胎兒甲床作為標(biāo)本。甲床兩種主要功能細(xì)胞，分別為上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，它對(duì)甲床的再生及形態(tài)的維持，起重要作用。

原代細(xì)胞的獲取，有組織塊培養(yǎng)法及消化法兩種。由于大多數(shù)情況下難以獲得大量的甲床標(biāo)本，可以根據(jù)標(biāo)本的大小來(lái)決定培養(yǎng)方法［2］。如果獲得的標(biāo)本較大，應(yīng)用胰酶消化法;在獲得的標(biāo)本較小的情況下，則應(yīng)用組織塊法培養(yǎng)。甲床上皮細(xì)胞屬于角化細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)相對(duì)困難，為了促進(jìn)角化細(xì)胞貼壁，不同學(xué)者采用過(guò)不同的方法。Nagae等［2］應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)甲床細(xì)胞成功，證明角化細(xì)胞培養(yǎng)液是甲床細(xì)胞的良好培養(yǎng)基。劉東昕等［3］采用胰酶消化法及應(yīng)用無(wú)血清角化細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)甲床上皮細(xì)胞，獲得成功。De Berker等［4］證實(shí)了甲基質(zhì)部位上皮細(xì)胞增殖旺盛，是甲板的主要來(lái)源。

細(xì)胞角蛋白只在上皮細(xì)胞或外胚層起源的細(xì)胞中表達(dá)，在不同細(xì)胞中有不同亞型表達(dá)［5］。角蛋白是上皮細(xì)胞主要的結(jié)構(gòu)蛋白和分化的標(biāo)志產(chǎn)物。角蛋白分為兩大類(lèi)，即皮膚型角蛋白和毛發(fā)角蛋白。皮膚型角蛋白主要表達(dá)于皮膚等部位，毛發(fā)型角蛋白主要表達(dá)于毛發(fā)、指甲等部位。Berker等［6］的實(shí)驗(yàn)表明，在甲床的上皮細(xì)胞中表達(dá)K17蛋白?？筀17免疫組織化學(xué)染色，證實(shí)甲床上皮細(xì)胞，同時(shí)也說(shuō)明甲床上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下，蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯改變。劉東昕等［3］也通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用抗K17免疫組織化學(xué)染色，證實(shí)甲床上皮細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用組織塊培養(yǎng)法成功地培養(yǎng)出甲床上皮細(xì)胞及甲床成纖維細(xì)胞，也證實(shí)了甲床上皮細(xì)胞在無(wú)血清角化細(xì)胞培養(yǎng)液中生長(zhǎng)良好。雖與酶消化法相比，獲取細(xì)胞時(shí)間上相多較長(zhǎng)，但組織塊法為傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法，容易操作，成功率高。而酶消化法的濃度及消化時(shí)間難以掌握，不易獲取，實(shí)驗(yàn)成功率低。組織塊培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn):①實(shí)驗(yàn)材料要新鮮，從活體分離材料后要低溫保存，并盡快進(jìn)行細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn);②遵守細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)菌操作;③分離細(xì)胞時(shí)，注意動(dòng)作要輕柔，不要傷到細(xì)胞組織，組織塊邊緣盡量平整有利于細(xì)胞游離;④培養(yǎng)過(guò)程中避免組織塊干燥脫水;⑤2 d內(nèi)避免過(guò)多觀察和晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，以防組織塊脫壁。

甲床缺損是常見(jiàn)的手外傷類(lèi)型，隨著顯微外科的發(fā)展，臨床工作者在不斷尋求甲床修復(fù)的最佳方法。雖然現(xiàn)在甲床修復(fù)方式較多，仍存較多缺點(diǎn)，如游離指(趾)甲床移植再造手指甲床，成活后指甲形態(tài)較美觀，卻會(huì)失去另一個(gè)相對(duì)次要的指(趾)甲;游離甲瓣修復(fù)術(shù)，可使傷指再生指甲、恢復(fù)手指感覺(jué)，卻需要一個(gè)足趾付出較大的代價(jià)。所以不管采用何種修復(fù)方法，均存在一定弊端。如果體外構(gòu)建組織工程甲床成功，將會(huì)避免以損害其他組織為代價(jià)。本研究體外培養(yǎng)甲床細(xì)胞成功，為進(jìn)一步構(gòu)建組織工程甲床奠定了基礎(chǔ)。

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