宣吉晴 XUAN Jiqing

李明星1 LI Mingxing

陳曉梅1 CHEN Xiaomei

羅志建1 LUO Zhijian

郭慶喜2 GUO Qingxi

2. 瀘州醫(yī)學(xué)院病理教研室 四川瀘州 646000

腎臟作為高灌注器官，極易發(fā)生腎缺血-再灌注損傷（ischemic reperfusion injury, IRI）。IRI對腎臟的功能和組織結(jié)構(gòu)均可造成明顯損傷，可引起腎臟細(xì)胞凋亡，腎實質(zhì)細(xì)胞喪失、細(xì)胞數(shù)目減少，引起血管收縮，降低腎臟血供，導(dǎo)致腎功能急劇下降。目前臨床上對于腎IRI的研究多見于血清生物化學(xué)、分子生物學(xué)及病理學(xué)檢測。彩色多普勒超聲作為一種實時、無創(chuàng)性檢查手段，能客觀動態(tài)地顯示腎皮質(zhì)血流灌注情況，從而提示腎缺血-再灌注后腎損傷的存在。細(xì)胞凋亡（apoptosis）是缺血-再灌注組織和器官損傷的途徑之一[1]，而bcl-2是體內(nèi)重要的抗凋亡基因，腎缺血-再灌注后在遠端腎小管高度表達保護腎功能[2]，測定腎小管上皮中Bcl-2蛋白的表達可以了解腎損傷的程度，判斷預(yù)后。本研究通過建立兔腎缺血-再灌注損傷模型，運用彩色多普勒血流顯像（CDFI）及脈沖多普勒（PW）技術(shù)檢測腎葉間動脈血流動力學(xué)改變，并檢測腎小管上皮Bcl-2蛋白表達情況，分析兩者間動態(tài)變化的關(guān)系，從而評價彩色多普勒超聲對兔腎缺血-再灌注損傷程度的檢測價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 兔腎缺血-再灌注損傷模型制備 健康成年日本大白兔48只（由瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），雌雄不限，體重1.8～2.4kg，平均（2.1±0.2）kg。經(jīng)耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉1.5ml/kg（中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司）麻醉，兔取仰臥位固定于手術(shù)臺上，上腹部備皮，行正中切口，約5cm，沿腹白線逐層分離，剪開腹膜，用濕紗布撥開腸管，暴露腎臟，切除右腎，以玻璃針小心分離左腎動、靜脈，保護輸尿管，用無創(chuàng)性動脈夾夾閉左腎動脈，阻斷血流1h，然后松開動脈夾恢復(fù)血供24h，復(fù)制腎缺血-再灌注損傷模型。缺血時觀察腎臟由鮮紅色立刻變?yōu)榘导t，恢復(fù)灌注后腎臟顏色恢復(fù)鮮紅，表明急性腎缺血-再灌注模型制備成功。

1.1.2 實驗分組 48只兔隨機分為兩組：①缺血-再灌注組（I/R組，n＝24），上述模型在恢復(fù)血流后根據(jù)時間又分為2h、8h、24h三個亞組；②假手術(shù)組（sham operation，S組，n＝24），僅行開腹、切除右腎，關(guān)腹；根據(jù)保留左腎時間分為2h、8h、24h三個亞組。

1.1.3 儀器及試劑 采用GE Logiq 9多普勒超聲診斷儀（通用電氣，美國）；熒光顯微鏡（日本尼康80i）；Bcl-2成套免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 觀察指標(biāo) 運用CDFI顯示腎動脈血流信號，各亞組均于術(shù)后2h、8h、24h運用PW取樣容積于腎椎體兩側(cè)緣葉間動脈獲取3個以上穩(wěn)定一致的血流頻譜，選用高頻線陣探頭，探頭使用中心頻率為10.0MHz，調(diào)整儀器設(shè)置，總增益為100，深度為5cm，量程為0～60cm/s，聲束與血流方向夾角＜60°，連續(xù)測量3次腎葉間動脈血流動力學(xué)參數(shù)，取平均值，并保存圖像。腎葉間動脈血流動力學(xué)參數(shù)測定指標(biāo)采用描記多普勒波形、儀器自動分析測量收縮期峰值流速（Vmax）、舒張末期流速（Vd）、時間平均峰值流速（Tamax）、搏動指數(shù)（PI）和阻力指數(shù)（RI），PI及RI按下式計算：PI＝（Vmax－Vd）/Tamax；RI＝（Vmax－ Vd）/Vmax。為減少因手法不同而產(chǎn)生的測量差異，均由同一人在相同的測量部位操作。

1.2.2 標(biāo)本采集 完成左腎動脈血流動力學(xué)測量后，根據(jù)分組情況在不同時間點處死動物，在低溫條件下開腹切除左腎，取部分左腎皮質(zhì)組織以10%甲醛固定，待測。腎組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟和包埋，常規(guī)切片（3μm）。一張作HE染色，制片顯微鏡觀察病理變化情況，分析腎小管損傷程度；另一張作免疫組化。

1.2.3 免疫組化SABC法測定腎小管中Bcl-2蛋白表達 ①免疫組化法染色：嚴(yán)格按照Bcl-2試劑盒說明操作。②結(jié)果判斷：400倍光鏡下觀察，照像。胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞膜呈棕黃色染色為陽性，不著色為陰性。每張切片隨機選取10個視野，采用Image Plus Pro 6.0圖像分析軟件進行分析，計算陽性細(xì)胞的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 10.0軟件分析，數(shù)據(jù)以表示，組間、組內(nèi)比較采用t檢驗；腎葉間動脈Vmax、Vd、Tamax、PI、RI與腎組織Bcl-2蛋白表達相關(guān)性采用Pearson直線相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDFI檢測兔腎葉間動脈血流動力學(xué)變化 二維超聲聲像圖均能清晰顯示大白兔左側(cè)腎臟，CDFI顯示各組腎葉間動脈血流充盈良好（圖1）。I/R組2h亞組與S組各亞組比較，腎葉間動脈血流動力學(xué)變化差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；I/R組8h亞組與S組各亞組比較，腎葉間動脈RI增大（P＜0.05），而Vmax、Vd、Tamax、PI差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）；I/R組24h亞組與S組各亞組比較，腎葉間動脈Vmax升高，RI及PI增大（P＜0.05），而Vd及Tamax差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 腎小管病理改變 光鏡下，S組腎小管均未見明顯病變，I/R組隨再灌注時間的延長，腎臟組織發(fā)生不同的病理改變。缺血-再灌注后2h，腎小管出現(xiàn)腫脹，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性；缺血-再灌注后8h，腎小管腫脹加重，管腔內(nèi)出現(xiàn)壞死脫落組織（圖3）；缺血-再灌注后24h，腎小管損傷程度最重，表現(xiàn)為大片腎小管上皮細(xì)胞腫脹呈空泡樣，腎小管中可見大量死亡脫落細(xì)胞殘留物質(zhì)，間質(zhì)及小管內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤（圖4）。

2.3 腎小管上皮細(xì)胞Bcl-2表達變化 正常腎小管上皮Bcl-2呈弱陽性表達，缺血-再灌注后Bcl-2表達上升，主要表達于外髓及遠曲小管，明顯較近曲小管強（圖5），隨時間推移表達范圍增加。I/R組2h、8h、24h平均光密度值與S組2h、8h、24h比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。I/R組Bcl-2表達24h（圖6）達高峰，與I/R組8h亞組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但I/R組8h與2h比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 缺血-再灌注各亞組腎血流動力學(xué)與Bcl-2蛋白表達的相關(guān)性分析 缺血-再灌注各亞組腎葉間動脈Vmax、PI、RI的改變與腎小管上皮細(xì)胞Bcl-2蛋白表達變化呈顯著正相關(guān)（r＝0.572、0.416、0.647，P＜0.05），而Vd、Tamax與Bcl-2表達均無明顯相關(guān)性（r＝0.154、0.213，P ＞ 0.05）。

表1 兩組腎葉間動脈血流動力學(xué)參數(shù)比較（ ）

表1 兩組腎葉間動脈血流動力學(xué)參數(shù)比較（ ）

注：（1）與S組比較，P＜0.05。Vmax：收縮期峰值流速；Vd：舒張末期流速；Tamax：時間平均峰值流速；PI：搏動指數(shù)；RI：阻力指數(shù)

表2 兩組兔腎缺血-再灌注后各時間點Bcl-2表達比較（ ）

表2 兩組兔腎缺血-再灌注后各時間點Bcl-2表達比較（ ）

注：（1）與S組比較，P＜0.05；（2）與8h比較，P＜0.05

3 討論

隨著彩色多普勒超聲技術(shù)的發(fā)展，因其無創(chuàng)、快捷、簡便、易于重復(fù)動態(tài)觀察等優(yōu)點在臨床上廣泛用于觀察腎臟疾病的血流動力學(xué)變化，如腎移植、腎血管病變等，其中血流指標(biāo)研究最多的參數(shù)是RI，多數(shù)學(xué)者研究段動脈、葉間動脈[3-8]。正常腎功能的實現(xiàn)有賴于腎臟的血流供應(yīng)及血流在腎內(nèi)的分布，而微循環(huán)障礙和血流動力學(xué)、血液流變學(xué)改變是腎缺血-再灌注損傷發(fā)生的重要機制之一[9]，因此，了解腎血流的供應(yīng)和分布將有助于對缺血-再灌注時腎損害的程度作出準(zhǔn)確評估。一些學(xué)者在移植腎的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)移植腎出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)及急性腎小管壞死時葉間動脈和弓形動脈變化較腎主動脈及段動脈明顯[10]，因此本研究選擇葉間動脈作為觀察指標(biāo)。

在恢復(fù)灌注后的早期，腎血管重新充盈，組織累積缺氧量的需要和損傷產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物會使血管持續(xù)擴張，血流量比缺血時明顯增加[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，再灌注2h時I/R組與S組比較，葉間動脈Vmax、Vd、Tamax、PI、RI差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但此時病理切片較S組已有改變，顯示腎小管腫脹，管腔開始擴張，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性，其原因可能是再灌注時間較短，已經(jīng)出現(xiàn)腎損傷，腎皮質(zhì)血流速度可能有一定改變，或稍有升高的趨勢，但變化不明顯，此時的血流動力學(xué)改變敏感性差。再灌注8h時I/R組葉間動脈RI顯著增大，與2h時比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)合病理改變，考慮原因可能是隨著腎缺血后再灌注損傷的加重，血管壁增厚，血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，引起血管腔縮窄，彈性降低，阻力進一步增加。再灌注24h時I/R組Vmax升高，PI及RI增大，Vd有所下降，而Tamax變化不明顯。此時病理表現(xiàn)腎損傷更為嚴(yán)重，大部分近曲小管上皮細(xì)胞呈空泡樣變，上皮細(xì)胞脫落至管腔明顯，并可見間質(zhì)充血和白細(xì)胞大量浸潤。研究表明，隨著缺血-再灌注時間推移，腎組織損傷產(chǎn)生并釋放花生四烯酸代謝產(chǎn)物，進而吸引大量白細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞上，引起腎小管周圍毛細(xì)血管網(wǎng)阻塞限制再灌流，血流阻力顯著增加[12]。這可能是再灌注24h后頻譜探測到葉間動脈出現(xiàn)收縮期血流速度加快、舒張期流速下降、阻力指數(shù)明顯增高的原因。

Bcl-2是研究最早的抗凋亡基因之一，在缺血-再灌注損傷中表現(xiàn)得尤為突出[13]。Bcl-2抗細(xì)胞凋亡的作用機制可能與以下幾個方面有關(guān)：①抑制Ca2+的釋放。②Bcl-2通過阻止促細(xì)胞凋亡基因信號傳遞或阻止這些誘導(dǎo)基因產(chǎn)物發(fā)揮作用。③抑制細(xì)胞色素C的釋放，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)抗氧化作用。本研究觀察到，兔正常腎小管上皮細(xì)胞Bcl-2呈弱陽性表達，缺血-再灌注損傷后隨時間推移Bcl-2表達增強，但8h組變化較2h組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），于再灌注24h后表達最高，較8h組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。腎小管上皮Bcl-2隨著缺血-再灌注損傷的加重表達增加，表明腎臟可能通過上調(diào)Bcl-2的表達拮抗缺血-再灌注損傷，從而起到保護腎功能的作用。兔腎缺血-再灌注24h內(nèi)腎葉間動脈Vmax、PI、RI與Bcl-2表達呈顯著正相關(guān)（r＝0.572、0.416、0.647，P＜0.05），葉間動脈Vmax、RI及 PI與Bcl-2峰值出現(xiàn)時間相同，RI與腎組織Bcl-2蛋白表達的變化具有很強的平行性。

綜上所述，隨著缺血-再灌注的時間推移，病理切片顯示腎損傷加重，腎小管上皮細(xì)胞Bcl-2表達增強，腎葉間動脈血流動力學(xué)也隨再灌注時間的延長發(fā)生改變，故監(jiān)測腎組織末端血管血流動力學(xué)改變是評價兔腎IRI的有效方法。彩色多普勒超聲能及時反映腎血流灌注異常，能為臨床對腎缺血-再灌注損傷提供可靠的診斷信息。正確認(rèn)識和分析超聲多普勒頻譜，特別是RI，對判斷腎缺血-再灌注損傷程度至關(guān)重要。

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