余 洋 綜述;劉 彥，牛忠英 審校

(解放軍第306醫(yī)院全軍口腔疾病診療中心，北京100101)

1990年，瑞士科學家首次提出“微全分析系統(tǒng)”的概念［1］。近年來，隨著超微加工技術的發(fā)展，這一分析技術在生物學和醫(yī)學領域的應用研究已經成為一個熱門方向［2-5］。持續(xù)的研究相應促進了該技術的不斷進步，使其應用范圍不斷擴大，2007年，有學者開始將這一技術引入口腔疾病診斷領域［6］，2011年裴振華，朱濤等首次將微流芯片技術應用到口腔細菌學研究中［7］。本文就微流芯片技術在口腔細菌定量檢測中的應用現(xiàn)狀做一綜述。

1 微流芯片

微流芯片又稱微流控芯片、芯片實驗室或微全分析系統(tǒng)［8］，是利用微加工技術在芯片上制做微閥、微通道、微反應倉、微傳感器、微壓力器、微檢測器等多種微流結構而構成的微型分析系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中可完成樣品的預處理、生化反應、分離、積聚、檢測等功能，體現(xiàn)了將分析實驗室的功能轉移到芯片上的設想。

2 微流芯片與細菌定量檢測

微流芯片檢測細菌，所需樣本液量小，能夠大大縮短檢測時間，易于實現(xiàn)設備的集成化和自動化，因此該方法已經成為近年來許多學者關注和研究的方向［9-11］。根據(jù)檢測原理的不同大致可分為電化學阻抗譜檢測、光學檢測、阻抗脈沖檢測和其他一些檢測方法等。

2.1 電化學阻抗譜檢測

給所測樣本液施加一個小振幅的頻率不同的交流電勢波，系統(tǒng)阻抗值會隨著頻率的變化而改變，每一個頻率值對應著溶液一個確定的電阻抗值，這就形成了阻抗譜圖［12］。電化學阻抗譜法因其對待測樣本表征和整體性能變化的敏感性，成為分析復雜電阻抗系統(tǒng)的強有力的工具［13］。根據(jù)細胞的電生理和阻抗特性，目前用阻抗譜定量檢測細菌細胞的研究方法分為三個方向:①細菌正常代謝產生的離子釋放和胞膜上離子交換，會引起系統(tǒng)阻抗值的變化。Silley等［14］通過測量這種阻抗信號，實現(xiàn)細菌數(shù)量的測量;②由于細胞膜的絕緣特性，細胞貼附在微電極表面上時，電極的表面積會減小，從而引起界面阻抗的增加，當細菌的粘附范圍達到一定程度時，能夠產生可檢測的阻抗信號。Varshney等［15］正 是 利 用 這 一 原 理，進 行 了O157∶H7型大腸桿菌的定量分析，同時，為了得到較強的阻抗信號，這些系統(tǒng)大多使用了氧化還原探針，比 如 ［Fe(CN)6］-3/-4，檢 測 范 圍 可 達104～107cfu/mL，整合納米微珠磁性分選技術的微流芯片的應用，使細菌數(shù)量檢測限度達到102～106cfu/mL［16-17］;③細胞內胞質富含離子，使用一定的方法裂解細胞或促使其釋放內部所含的帶電離子，就能夠檢測到阻抗的變化。電通透作用可大大提高細胞膜的離子通透性，從而增加離子釋放，科研人員用此種方法，可檢測低至102cfu/mL大腸桿菌［18］。Yang 等［19］用去離子水懸浮大腸桿菌，促使高離子濃度細胞質向外界環(huán)境釋放離子，通過測量去離子水溶液阻抗值變化，可獲得細菌濃度，該套系統(tǒng)的檢測范圍達至105～109cells/20 μL。

2.2 光學檢測

根據(jù)光學原理的不同，這一領域里可細分為吸光光度檢測、化學發(fā)光檢測、熒光檢測等檢測技術。

2.2.1 吸光光度檢測

吸收光度檢測是基于物質對光的選擇性吸收而建立起來的一種分析方法，包括比色法、可見紫外吸光光度法、紅外光譜法等。它具有靈敏、準確、快速、可測定的物質種類多、儀器結構較簡單等優(yōu)點，適用于微量組分的測定。Lin等(2004)［21］報告了一種應用比色分析法檢測大腸桿菌的微流芯片，菌體與金納米微珠(直徑80 nm)上包被的抗體發(fā)生免疫反應，比色定量測定溶液顏色強度的改變，系統(tǒng)的檢測限為10 ng。Li等［21］設計的微流芯片，含有免疫固定的抗體，捕獲大腸桿菌后，用紫外-可見分光光度計進一步檢測，最低檢測限為102cfu/mL。

2.2.2 化學發(fā)光檢測

在一些特殊的化學反應中，基態(tài)分子吸收反應中釋放的化學能躍遷至激發(fā)態(tài)，處在激發(fā)態(tài)的分子以光輻射的形式將能量釋放而返回基態(tài)，產生化學發(fā)光?；瘜W發(fā)光檢測正是通過測量這些反應中的光強度來測定被測物質的含量。這種方法具有很高的靈敏度，且不需要光源，儀器設備簡單，易于集成化，是微流控芯片分析系統(tǒng)理想的檢測方法之一。Han等［22］制作了Y型腔道的PDMS材料的微流芯片，大腸桿菌K1Ⅱ型與共軛抗大腸桿菌多克隆抗體的羧基聚苯乙烯微球，分別通過Y型腔道的兩側進樣口注入芯片，兩者在中間的匯聚腔道發(fā)生乳膠免疫凝集反應，用“極近”芯片的光纖測定反應時光散射強度的增加量，將結果繪制成光密度與菌濃度的校準曲線進行定量分析，可檢測的濃度范圍為0～104cfu/mL。

2.2.3 熒光檢測

激光誘導熒光檢測法，是目前微流控芯片系統(tǒng)中最常用的檢測方法，具有很高的靈敏度、良好的選擇性和較寬的線性范圍。基于激光誘導熒光原理的檢測器也是目前芯片商品化趨勢中唯一被采用的一種檢測器。大多數(shù)生物細胞能夠產生自體熒光，熒光來源于機體的代謝產物和自身組分。Bao等［23］發(fā)明了一種能夠對細菌裂解產物產生的自發(fā)熒光進行激光誘導檢測的微流芯片，試驗中觀察到三種標準菌-李斯特菌F4244、腸炎沙門菌PTI和大腸桿菌O157:H7EDL933的自發(fā)熒光密度隨菌數(shù)量的增長而增加，兩者幾乎成線性關系。該芯片檢測限為240～4 100 cells/mL。微流芯片技術的引入，成功實現(xiàn)了流式細胞儀的微型化，整合流式細胞術的微流芯片定量分析也因此成為近年來學者們研究的一個熱門方向。Skamoto［24］的研究組應用設計的此類芯片檢測河水中的大腸桿菌，能夠檢測到的濃度范圍達106～107cells/mL，而他們通過對實驗條件摸索優(yōu)化之后重新設計的芯片，對熒光標記的大腸桿菌檢測限達到104～106cells/mL。

2.3 阻抗脈沖檢測

阻抗脈沖檢測是檢測單個粒子和細胞大小及數(shù)量的一種優(yōu)質方法，它能夠檢測出非導電粒子通過感應腔道時電阻抗值的變化。目前廣泛應用的庫爾特計數(shù)器正是這一技術強大生命力的體現(xiàn)。微納米技術的進步，使基于微流芯片技術的微型化阻抗脈沖檢測器檢測微納米粒子成為現(xiàn)實。Song等［26］使用的微流芯片由一個單腔道和兩個定位在傳感部分末端的檢測壁腔道和外部鏈接的兩級差分放大器組成，細菌流過感應部分的流速與菌濃度成線性函數(shù)關系。利用高信噪比信號，系統(tǒng)完成了4種不同細菌—李斯特菌、沙門氏菌、志賀菌、綠膿桿菌的定量分析，檢測限精確到5×106～5×107cfu/mL。Skamoto［27］的研究組應用課題組設計的此類芯片檢測河水中的大腸桿菌，能夠檢測到的濃度范圍達106～107cells/mL，而他們通過該實驗摸索了優(yōu)化條件之后重新設計的芯片，對經熒光標記的大腸桿菌檢測限達到104～106cells/mL。

3 微流芯片在口腔細菌定量分析中的初步應用

總結近年來芯片實驗室技術在一般細菌學定量檢測中的現(xiàn)況，研究主要集中在食源性致病菌和外界環(huán)境中常見的微生物的計量分析上，而該技術在口腔致病菌檢測上的應用研究剛剛起步。裴振華，朱濤等(2011)［27］率先應用自己設計的基于液體電極的微流芯片，結合電化學阻抗譜原理，定量檢測了成人牙周炎主要致病菌-牙齦卟啉單胞菌，研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的牙齦卟啉單胞菌的電化學阻抗譜有顯著差異，通過阻抗值可以區(qū)分不同濃度的牙齦卟啉單胞菌。該研究成為微流芯片在口腔細菌學領域應用的開端。

3.1 基于液體電極微流芯片結構特點

這個芯片由前部三條進樣腔道、中間一條檢測腔道和尾部3條廢液排出腔道組成。實驗時由外側的兩個進樣腔道勻速注入高導電的氯化鉀液，中間的進樣腔道勻速注入一定濃度的細菌懸浮液，根據(jù)流體的流動聚焦原理，兩側的氯化鉀液會擠壓中間的菌懸液形成穩(wěn)定的層流，這里的氯化鉀液不僅具有鞘流作用，而且作為整個芯片系統(tǒng)的液體電極使用。因此該液體電極與固體電極相比具有操作便利、所需試劑簡單、費用低廉等優(yōu)點，同時可在很大程度上減少固體電極中可能存在的樣本液與金屬反應的現(xiàn)象，具有較高的臨床應用價值［28］。

3.2 微流芯片定量檢測牙齦卟啉單胞菌的原理

牙齦卟啉單胞菌標準菌株經過復蘇、培養(yǎng)、增菌、計數(shù)板計數(shù)、梯度稀釋、離心、洗滌后，用去離子水重懸靜置20 min，以促使細菌細胞質中的離子充分釋放。研究中發(fā)現(xiàn):如果流體流速過快，會造成芯片的滲漏，而流速過慢時，流層交界處圖像模糊，實驗結果不可靠。因此經過對實驗條件的摸索，樣本液及氯化鉀液的流速定在1 mL/h。為了進一步證明該流速對檢測敏感性的影響，研究人員保持氯化鉀液流速不變，菌懸液分別以1.5 mL/h和2 mL/h的速率流動，將阻抗分析儀記錄的數(shù)據(jù)制成電導-菌濃度對數(shù)線性關系圖，通過分析發(fā)現(xiàn):流速為1 mL/h時，線性斜率最大，這就意味著此時芯片敏感性最高。實驗證明:當交流電壓的頻率為100 Hz～10 kHz時，不同濃度的細菌液阻抗值有顯著差異，隨著細菌濃度的增加，阻抗值梯度減小;同一濃度的菌液，阻抗-頻率曲線基本是一條與橫軸平行的線，進一步分析系統(tǒng)等效電路可知，低頻時系統(tǒng)電路阻抗相當于電阻R的阻抗，針對本研究體系，其中電阻包括細菌液和高導電氯化鉀液的共同電阻，而由于高導電氯化鉀溶液的電阻相對很小，所以主要可用細菌液的電阻來解釋;而當頻率超過100 kHz時，這一現(xiàn)象消失。因為在高頻率時，系統(tǒng)阻抗值的變化主要受雙層液電容阻抗而不是細菌液阻抗的影響，因此系統(tǒng)阻抗與細菌濃度之間無明顯對應關系。當頻率恒定在1.2 kHz時，細菌濃度的對數(shù)與阻抗值呈線性關系，相關系數(shù)達0.99。芯片能夠區(qū)分濃度為:103～109cells/mL［27］。該項技術申請了專利:一種應用電化學阻抗原理檢測細菌的方法及微流控芯片(申請?zhí)?201010100832.2)。

4 微流芯片技術在臨床口腔細菌學檢測中應用

4.1 特異性檢測方法的建立

檢測方法的高度特異性，是臨床運用的首要條件，為此研究者采用牙齦卟啉單胞菌牙齦蛋白酶K抗體包被的納米磁珠對細菌進行特異性捕獲，外加磁場下進行免疫磁分離，最后通入芯片檢測。為了驗證這種方法的特異性，實驗中使用中間普氏菌作為雜菌與牙齦卟啉單胞菌混合，用納米磁珠蛋白酶K抗體復合物與混合菌液反應，最后通過PCR方法鑒定磁珠捕獲的細菌。同時為了驗證該方法在復雜口腔環(huán)境中應用的可行性，磁珠抗體復合物分別與含有(2.13×103～2.13×109)cells/mL牙齦卟啉單胞菌的唾液、血清、膿液反應，免疫磁分離后通入芯片檢測阻抗譜的變化。通過研究發(fā)現(xiàn):結合免疫磁分離技術后，芯片對細菌的檢測限升高;免疫磁分離法特異性好;唾液和血清對牙齦卟啉單胞菌的檢測限無明顯影響，但唾液使檢測靈敏度有所降低。膿液使牙齦卟啉單胞菌的檢測限及檢測靈敏度明顯降低［31］。

4.2 檢測粘結性牙周夾板固定病人齦溝液中的牙齦卟啉單胞菌和血鏈球菌

裴振華(2011)［29］利用微流芯片結合免疫磁分離方法，建立了牙齦卟啉單胞菌和血鏈球菌的阻抗—細菌濃度對數(shù)線性關系圖和函數(shù)式。通過關系式量化分析了粘結性夾板固定病人初診、夾板固定即刻、固定后2周、4周時炎癥和健康對照位點齦溝液中的牙齦卟啉單胞菌和血鏈球菌，同時記錄相應階段牙周臨床指標包括菌斑指數(shù)、齦出血指數(shù)、探針深度和臨床附著水平的變化，通過與臨床指標和細菌培養(yǎng)以及實時定量PCR結果作對照，分析粘結性牙周夾板固定前后牙周微生態(tài)的變化，對該方法的臨床應用價值進行了初步評估。

5 結論

應用微流芯片定量檢測口腔細菌尚處在初步研究階段，它為口腔細菌學領域里細菌定量檢測的方法開辟了新的途徑。由于口腔環(huán)境的復雜性，臨床所取樣本含有眾多的干擾因素，少量雜菌的混入以及樣本預處理過程中可能引入的一些離子成分、抗體的結合率，反應的溫度、時間、反應物濃度、pH等都會對檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性、敏感性產生影響。因此，進一步優(yōu)化實驗條件，完善試驗方法，設計更加敏感、特異、抗干擾能力強的芯片，提高臨床應用價值，將成為該領域未來的重點研究方向之一。

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