劉 亮，左 靜，左連富*，郭建文

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院1.腫瘤研究所流式細胞室，河北石家莊050011;2.腫瘤內科，河北石家莊050011)

食管癌是我國較常見的惡性腫瘤，尤其是河北省的磁縣，食管癌發(fā)病率及死亡率較高?？鼓[瘤藥物較大的不良反應是導致化療效果下降的主要原因之一，尋找高效低毒的抗腫瘤藥物，是腫瘤學研究者長期從事的工作。中藥治療腫瘤已具有幾千年的歷史，具有低毒、價廉等優(yōu)點。青蒿琥酯 (Artesunate，Art)化學名為二氫青蒿素-1，2-α-2琥珀酸單酯，是具有倍半萜結構的抗瘧藥青蒿素的衍生物之一，研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯除了具有抗瘧作用以外還具有抗腫瘤活性［1－2］，但在食管癌中的研究較少。本實驗主要研究青蒿琥酯誘導食管癌細胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系來源:人食管癌細胞系Eca109細胞為本實驗室傳代培養(yǎng)。

1.1.2 主要實驗儀器及試劑:Epics-XLⅡ型流式細胞儀 (Beckman-Coulter公司);BCL-2抗體(克隆號:sc-7480)及BAX抗體(克隆號:sc-7382)(Santa Cruz公司);青蒿琥酯(批號:ZA070802)(桂林南藥有限公司);胎牛血清(杭州四季青公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥物干預實驗:取對數(shù)生長期的Eca109細胞以1×106/mL接種至細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后，加入不同濃度的青蒿琥酯，使終濃度分別達到10、20、40 mg/L，對照組使用0.9%氯化鈉代替青蒿琥酯，作用24 h后，收集細胞，PBS液洗滌2次，部分細胞70%乙醇固定放入4℃冰箱保存用于流式細胞術檢測，部分細胞用于Western blot檢測。每組實驗重復3次。

1.2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率及細胞周期:調整每份樣品的細胞數(shù)為1×106/100μL，加入50 mg/L PI染液1 mL，在4℃冰箱中染色30 min，上機檢測DNA含量。應用Expo 32 ADC軟件對凋亡

1.2.3 流式細胞術檢測細胞中BCL-2及BAX蛋白表達量:調整每份樣品的細胞數(shù)為1×106/100μL，分別加入小鼠抗人BCL-2及BAX抗體，常溫放置30 min，PBS液洗滌2次，加入1∶50稀釋的羊抗小鼠FITC標記的IgG二抗，常溫下放置30 min，PBS液洗滌2次，上流式細胞儀檢測。流式細胞術檢測蛋白含量以平均熒光強度表示。

1.2.4 Western blot方法檢測細胞中BCL-2及BAX蛋白表達水平:冷PBS洗滌細胞2次，使用RIPA試劑常規(guī)方法提取細胞蛋白。常規(guī)Western blot方法檢測細胞中BCL-2及BAX蛋白，其中β-actin為內參照。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 流式細胞術檢測細胞凋亡率及細胞周期

10、20、40 mg/L青蒿琥酯作用 Eca109細胞24 h后，與對照組相比，細胞凋亡率顯著增高(p＜0.05)，細胞增殖指數(shù)顯著降低(p＜0.05)，細胞G0/G1期顯著增高(p＜0.05)，且具有劑量依賴性(表1，圖 1，2)。

2.2 流式細胞術檢測細胞中BCL-2及BAX蛋白表達水平

表1 流式細胞術檢測不同濃度Art作用Eca109細胞24 h細胞凋亡率及細胞周期Table 1 The cell apoptosis rate and cell cycle of Eca109 cells after the treatment of different concentrations of Art for 24 hours assayed by flow cytometry，n=3)

表1 流式細胞術檢測不同濃度Art作用Eca109細胞24 h細胞凋亡率及細胞周期Table 1 The cell apoptosis rate and cell cycle of Eca109 cells after the treatment of different concentrations of Art for 24 hours assayed by flow cytometry，n=3)

*p＜0.05 compared with Art 40 mg/L group

Art(mg/L)apoptosis rate(%)G0/1 phase(%)PI(%)0 1.52±0.09* 44.53±0.51* 55.46±0.51*10 5.26±0.20* 50.90±1.51* 49.10±1.51*20 18.39±1.58* 56.53±1.58* 43.47±1.58*40 26.78±1.09 61.60±2.44 38.40±2.44

青蒿琥酯組與對照組相比，細胞中BCL-2蛋白表達水平顯著降低(p＜0.05)，細胞中BAX蛋白表達水平顯著增高(p＜0.05)，且具有劑量依賴性(表2，圖3，4)。

2.3 Western blot方法檢測細胞中BCL-2及BAX蛋白表達水平

青蒿琥酯實驗組與對照組相比，Eca109細胞中BCL-2蛋白表達水平降低，BAX蛋白表達水平增高(圖5)，與流式細胞術檢測結果一致。

表2 流式細胞術檢測不同濃度Art作用Eca109細胞24 h細胞中BCL-2和BAX蛋白表達水平Table 2 The BCL-2 and BAX protein expression level of Eca109 cells after the treatment of different concentrations of Art for 24 hours assayed by flow cytometry(，n=3)

表2 流式細胞術檢測不同濃度Art作用Eca109細胞24 h細胞中BCL-2和BAX蛋白表達水平Table 2 The BCL-2 and BAX protein expression level of Eca109 cells after the treatment of different concentrations of Art for 24 hours assayed by flow cytometry(，n=3)

*P ＜0.05 compared with Art 40 mg/L group．

Art(mg/L)BCL-2 protein BAX protein 0 420.28±6.04* 248.95±5.47*10 369.99±16.22* 292.65±9.47*20 322.34±14.11* 422.23±7.46*40 179.01±10.35 479.22±8.33

2.4 青蒿琥酯作用后Eca109細胞中BCL-2及BAX蛋白表達相關性分析

青蒿琥酯作用后，Eca109細胞中BCL-2及BAX蛋白表達呈顯著負相關(pearson相關系數(shù)=－0.922，P=0.000)。

圖3 流式細胞術檢測不同濃度Art作用Eca109細胞24h細胞中BCL-2蛋白表達水平Fig 3 The BCL-2 protein expression level of Eca109 cells after the treatment of different concentrations of Art for 24 hours assayed by flow cytometry

圖4 流式細胞術檢測不同濃度Art作用Eca109細胞24h細胞中BAX蛋白表達水平Fig 4 The BAX protein expression level of Eca109 cells after the treatment of different concentrations of Art for 24 hours assayed by flow cytometry

圖5 Western blot方法檢測Eca109細胞中BCL-2及BAX蛋白表達水平Fig 5 The BCL-2 and BAX protein expression of Eca109 cells assayed by Western blot

3 討論

食管癌是我國較常見的惡性腫瘤，目前食管癌的化療效果欠佳，主要原因在于藥物不良反應較大和多藥耐藥的產生，尋找低毒、不耐藥的抗腫瘤藥物就顯得十分重要。中藥治療腫瘤已有久遠的歷史，具有不良反應少，價格低等優(yōu)點。青蒿琥酯是青蒿素衍生物之一，具有較好的抗瘧作用［3－4］，尤其對重型和耐藥型瘧疾具有較好的療效［5－7］，進一步研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯還具有調節(jié)免疫、抗血吸蟲及抗腫瘤作用［8－9］。本實驗主要研究青蒿琥酯誘導食管癌細胞凋亡作用，為臨床上尋找高效、低毒的抗食管癌藥物提供實驗基礎。

大量文獻報道，青蒿琥酯抗腫瘤主要是通過誘導細胞凋亡而發(fā)揮作用［10－11］，但少見在食管癌中的研究，在本實驗中選取了青蒿琥酯的3個濃度，發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可以誘導食管癌Eca109細胞產生凋亡，而起到抗食管癌作用，且誘導細胞凋亡作用具有青蒿琥酯劑量依賴性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯作用后抗凋亡基因蛋白BCL-2表達水平顯著降低，而BAX蛋白表達水平顯著升高，其兩者之間具有顯著的負相關性。降低細胞中BCL-2蛋白表達水平，升高BAX蛋白表達水平可以誘導細胞凋亡。本研究除了發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯通過誘導細胞凋亡而起到抗食管癌作用外，實驗中還發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯可以顯著降低Eca109細胞增殖指數(shù)，抑制食管癌細胞增殖，將其細胞周期阻滯在G0/G1期。

綜合本實驗研究，提示青蒿琥酯具有抗食管癌作用。青蒿琥酯抗食管癌作用與誘導細胞凋亡、細胞周期阻滯及抑制細胞增殖有關。青蒿琥酯具有低毒、高效及價廉等優(yōu)點，如果能將其開發(fā)為抗腫瘤藥物，將具有廣泛的應用前景。

［1］Thanaketpaisarn O，Waiwut P，Sakurai H，et al．Artesunate enhances TRAIL-induced apoptosis in human cervical carcinoma cells through inhibition of the NF-κB and PI3K/Akt signaling pathways［J］．Int J Oncol，2011，39:279 －285．

［2］Michaelis M，Kleinschmidt MC，Barth S，et al．Anti-cancer effects of artesunate in a panel of chemoresistant neuroblastoma cell lines［J］．Biochem Pharmacol，2010，79:130－136．

［3］Gbotosho GO，Sowunmi A，Okuboyejo TM，et al．Therapeutic efficacy and effects of artemether-lumefantrine and artesunate-amodiaquine coformulated or copackaged on malaria-associated Anemia in children with uncomplicated plasmodium falciparum malaria in southwest nigeria［J］．Am JTrop Med Hyg，2011，84:813 －819．

［4］Avabratha KS，Chettiyar LA，John NP．Oral artesunate for neonatal malaria［J］．J Trop Pediatr，2010，56:452 －453．

［5］Shanks GD．For severe malaria，artesunate is the answer［J］．Lancet，2010，376:1621 －1622．

［6］Zoller T，Junghanss T，Kapaun A，et al．Intravenous artesunate for severe malaria in travelers，europe［J］．Emerg Infect Dis，2011，17:771－777．

［7］Bello SO．Pre-referral artesunate in severe malaria［J］．Lancet，2009，373:1762 －1763．

［8］ Konkimalla VB，McCubrey JA，Efferth T．The role of downstream signaling pathways of the epidermal growth factor receptor for Artesunate's activity in cancer cells［J］．Curr Cancer Drug Targets，2009，9:72 －80．

［9］Steinbrück L，Pereira G，Efferth T．Effects of artesunate on cytokinesis and G2/M cell cycle progression of tumour cells and budding yeast［J］．Cancer Genomics Proteomics，2010，7:337－346．

［10］Li B，Yao Q，Pan XC，et al．Artesunate enhances the antibacterial effect of{beta}-lactam antibiotics against Escherichia coli by increasing antibiotic accumulation via inhibition of the multidrug efflux pump system AcrAB-TolC［J］．JAntimicrob Chemother，2011，66:769 －777．

［11］Hamacher-Brady A，Stein HA，Turschner S，et al．Artesunate activates mitochondrial apoptosis in breast cancer cells via iron-catalyzed lysosomal reactive oxygen species production［J］．JBiol Chem，2011，286:6587－6601．