黃艷，盧安根，楊益林，莫建光

（廣西分析測(cè)試研究中心，廣西 南寧 530022）

提高水牛奶中共軛亞油酸含量的菌種篩選

黃艷，盧安根，楊益林，莫建光

（廣西分析測(cè)試研究中心，廣西 南寧 530022）

在水牛奶中分別添加不同的菌種進(jìn)行發(fā)酵，通過溶劑法提取發(fā)酵乳中的脂肪，采用BF3/甲醇對(duì)脂肪酸進(jìn)行甲酯化，使用紫外分光光度法與氣相色譜法相結(jié)合進(jìn)行發(fā)酵乳中共軛亞油酸的含量測(cè)定。結(jié)果顯示，經(jīng)單一菌種發(fā)酵的水牛奶其共軛亞油酸（CLA）的含量均有一定的提高，其中德式乳桿菌保加利亞亞種的轉(zhuǎn)換能力相對(duì)最高。

水牛奶；共軛亞油酸；紫外分光光度；氣相色譜

共軛亞油酸（Conjugated Linoleic Acid，CLA）是近20年來人類發(fā)現(xiàn)的最重要的功能性脂肪酸，作為一種類脂功能性因子，CLA具有抑制癌癥和腫瘤的形成、減肥、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善免疫功能、降低膽固醇、促進(jìn)生長(zhǎng)、促進(jìn)骨組織代謝、預(yù)防糖尿病的發(fā)生等多種生物活性[1]。

水牛奶是地方特色產(chǎn)品，在中國(guó)，只有廣東、江西、廣西等5個(gè)省有水牛。廣東人熟悉的姜撞奶、雙皮奶等，都必須用水牛奶來制作。水牛奶營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，乳脂率含量為7.9%，而普通牛奶一般是3%～3.5%。由于牛奶是人們補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較快的途徑之一，所以提高水牛奶中CLA的含量，讓人們更好地獲取CLA具有重要意義[2]。

為了增加牛奶中CLA的含量，以便從中獲得更多的CLA，國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)黑花牛奶CLA的形成機(jī)理進(jìn)行了很多研究，表明牛奶的CLA含量與奶牛的飼料息息相關(guān)，增加油脂類飼料，可提高牛奶中CLA含量。但到目前為止國(guó)內(nèi)外用發(fā)酵法提高水牛奶中CLA的研究報(bào)道較少。

研究利用紫外分光光度法結(jié)合氣相色譜法快速準(zhǔn)確檢測(cè)發(fā)酵乳中CLA含量。水牛奶中添加不同微生物菌種進(jìn)行發(fā)酵研究，提高水牛奶中的CLA含量，為開發(fā)功能性水牛奶制品提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、德式乳桿菌保加利亞亞種：廣東省微生物菌種保藏中心提供。

水牛奶：廣西農(nóng)科院水牛奶。

1.1.2 培養(yǎng)基[3]

分離平板培養(yǎng)基：MRS。

保存培養(yǎng)基：MRS瓊脂培養(yǎng)基；脫脂牛奶培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基：水牛奶液態(tài)培養(yǎng)基。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

UV1902雙光束紫外分光光度計(jì)：美國(guó)熱電；安捷倫6890N氣相色譜儀：美國(guó)安捷倫。

1.1.4 試劑

共軛亞油酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品（高級(jí)純）。

分析純氨水、95%乙醇、無水乙醚、石油醚、BF3/甲醇、正己烷，氯化鈉等。

1.2 方法

1.2.1 水牛奶中脂肪的提取

1.2.1.1 方法一

1.稱取適量的水牛奶放入毛氏抽脂瓶中，加入2mL的25%的氨水，放入65℃水浴鍋中水浴15 min，取出輕搖，冷卻至室溫；2.加入10 mL乙醇，加入25 mL乙醚，塞上塞子振搖1min。加入25mL石油醚，振搖1min。靜止分層。有機(jī)層轉(zhuǎn)入燒瓶中。反復(fù)提取3次。

1.2.1.2 方法二

將水牛奶在10℃以下、10000 r/min的條件下，離心30 min，取上層固體于50 mL試管中，加入18 mL的正己烷/異丙醇混合溶液，再加入2 mL的丙酮混勻，在溶液中加入硫酸鈉，靜置分離兩相，分離上層有機(jī)相于燒瓶中。

1.2.1.3 方法三

稱取適量水牛奶于離心管中，加入正己烷/異丙醇混合液4 mL漩渦振蕩2 min，加入3 mL硫酸鈉溶液，漩渦振蕩2 min后，靜置10 min～20 min。取上清液。

1.2.2 脂肪酸甲酯化

在提取得到的水牛奶脂肪中加入8 mL BF3/甲醇，65℃回流15 min，加入10 mL正己烷回流1 h，取出冷卻至室溫加入4 mL飽和食鹽水，輕搖數(shù)次后，移入分液漏斗中，靜置分層，將上層液體轉(zhuǎn)移到燒瓶中。再用8 mL的正己烷萃取3次，合并萃取液，過無水Na2SO4以除去其中痕量的水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用正己烷定容到10 mL。所得液為待測(cè)液。

1.2.3 最大吸收波長(zhǎng)掃描與標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立[4-5]

用紫外分光光度儀對(duì)同一濃度的共軛亞油酸甲酯進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，確定其最大吸收波長(zhǎng)。

根據(jù)共軛亞油酸甲酯的最大吸收波長(zhǎng)下其吸光度與濃度的關(guān)系，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。準(zhǔn)確量取0.1 mL的CLA標(biāo)準(zhǔn)樣品，放入錐形瓶中甲酯化，定容到 10 mL，分別移取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、1.0 mL試液于10 mL容量瓶中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度。

1.2.4 氣相色譜測(cè)定條件[6]

色譜柱：DB-23，30 m×0.25 mm，0.25 μm；升溫程序：初始溫度140℃，以80℃/min升至250℃；進(jìn)樣器溫度：250℃；檢測(cè)器FID溫度：300℃；載氣：氮?dú)?；載氣流速：1.0 mL/min。

1.2.5 水牛奶中菌種的發(fā)酵

1.2.5.1 菌種活化

用無菌水使凍干菌體溶解呈懸浮狀，移植到牛奶培養(yǎng)基中37℃靜置培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)接至MRS或者牛奶+MRS混合培養(yǎng)基上。挑一單菌落轉(zhuǎn)接至MRS培養(yǎng)基中（或用牛奶+MRS混合培養(yǎng)基），進(jìn)行分離純化，確認(rèn)無雜菌后鏡檢觀察菌落形態(tài)是否與該菌的生理形態(tài)一致，最后放置4℃保藏。

1.2.5.2 水牛奶預(yù)處理

用巴氏消毒處理，將新鮮水牛奶分裝到500 mL瓶子中，蓋好蓋子后放入65℃水浴鍋中1 h。巴氏消毒后的水牛奶需做菌落總數(shù)平板計(jì)數(shù)驗(yàn)證。

1.2.5.3 發(fā)酵培養(yǎng)

不同菌種按2%菌液分別接種至50 mL已巴氏消毒的水牛奶中（37℃，pH 6.45）靜置培養(yǎng)24 h。

實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行樣，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取水牛奶脂肪的方法比較

提取水牛奶脂肪方法的比較，如表1所示。

表1 抽提水牛奶脂肪方法的比較Table 1 Compared the method with extraction of water milk's fat

經(jīng)過幾種提取水牛奶中脂肪的方法，由表1可知方法一提取脂肪效果較好，所以采用方法一來作為我們今后提取發(fā)酵乳中脂肪的方法。

2.2 共軛亞油酸甲酯的紫外吸收光譜掃描

共軛亞油酸甲酯的紫外吸收光譜掃描見圖1。

圖1 共軛亞油酸甲酯的紫外吸收光譜掃描Fig.1 Scan CLA of the wavelength of maximum

從圖1中可以看出CLA甲酯的最大吸收波長(zhǎng)為233 nm。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸公式

利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 共軛亞油酸甲酯的工作曲線及回歸方程Fig.2 Standard curve of CLA

回歸公式為：y=7.45x+0.0282（R2=0.9992）。

牛奶中共軛亞油酸含量的計(jì)算公式：

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線得到CLA甲酯的濃度，（mg/g）；V1為樣品稀釋的體積，mL；V2為取樣的體積，mL；M為水牛奶取樣質(zhì)量，g。

2.4 發(fā)酵乳CLA檢測(cè)結(jié)果

1.發(fā)酵中未添加亞油酸底物，通過紫外分光光度法與氣相色譜法測(cè)定發(fā)酵乳中CLA含量，2種方法進(jìn)行對(duì)比，測(cè)結(jié)果相互吻合，確保篩菌過程中首先使用紫外分光光度法粗篩的準(zhǔn)確性，見表2。

表2 發(fā)酵后水牛奶CLA含量測(cè)定（未添加底物L(fēng)A）Table 2 The content of CLA in fermented milk（without Substrate LA） m g/100 g

如表2所示，我們發(fā)現(xiàn)4種菌種在一定程度上均提高了水牛奶中CLA的含量，其中德式乳桿菌保加利亞亞種的轉(zhuǎn)化能力稍高。

2.發(fā)酵中添加亞油酸（1 mg/mL）底物，通過紫外分光光度法與氣相色譜法測(cè)定發(fā)酵乳中CLA含量見表3。如表3所示，在發(fā)酵時(shí)添加與不添加亞油酸為底物，沒有對(duì)發(fā)酵乳中CLA的含量有所改變。

3 結(jié)論

進(jìn)入21世紀(jì)以來，人們?cè)絹碓阶非蠼】档纳睿珻LA的健康功效受到人們的關(guān)注，消費(fèi)者對(duì)其需求越來越迫切。而CLA主要存在于反芻動(dòng)物的乳脂和肉制品當(dāng)中，水牛奶由于具有全面的營(yíng)養(yǎng)，被認(rèn)為是較好的共軛亞油酸食物來源，水牛奶中CLA的定量分析是確定牛奶脂肪酸營(yíng)養(yǎng)的一個(gè)重要依據(jù)，因此提高水牛奶中CLA的含量是我們努力的方向。

表3 發(fā)酵后水牛奶CLA含量測(cè)定（添加底物L(fēng)A）Table 3 The content of CLA in fermented milk（with Substrate LA）m g/100 g

用微生物發(fā)酵法，利用整個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化或酶催化轉(zhuǎn)化，將亞油酸及其衍生物轉(zhuǎn)化成CLA，可以克服化學(xué)轉(zhuǎn)化法的缺點(diǎn)。而且生物法生成的異構(gòu)體單一，反應(yīng)條件溫和，生成的CLA異構(gòu)體單一的特點(diǎn)，逐漸受到人們的重視，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些瘤胃菌、丙酸菌和乳酸菌等具有將LA人轉(zhuǎn)化為CLA的能力。這些微生物中含有亞油酸異構(gòu)酶，其作用點(diǎn)是在脂肪酸C12雙鍵上，能把亞油酸特異性轉(zhuǎn)化為c9，t11-CLA[6-7]。我們?cè)谒Ｄ讨蟹謩e添加了保加利亞乳桿菌、德式乳桿菌保加利亞亞種、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌等4種微生物，發(fā)酵培養(yǎng)24 h，使用篩選效果良好的水牛奶脂肪提取方法提取發(fā)酵乳脂肪，進(jìn)行甲酯化，通過紫外分光光度法與氣相色譜法測(cè)定發(fā)酵乳中CLA含量，發(fā)現(xiàn)4種菌種在一定程度上均提高了水牛奶中CLA的含量，其中德式乳桿菌保加利亞亞種的轉(zhuǎn)化能力稍高。

實(shí)驗(yàn)表結(jié)果表明，在發(fā)酵時(shí)添加與不添加亞油酸為底物，沒有對(duì)發(fā)酵乳中CLA的含量有所改變。本次實(shí)驗(yàn)添加的LA濃度為1.0 mg/mL，可能是因?yàn)樘幱趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種對(duì)底物較為敏感，菌種的生長(zhǎng)處于抑制狀態(tài)，但添加亞油酸底物是否有利于發(fā)酵水牛奶提高CLA含量還需要更多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

[1]張英鋒,李長(zhǎng)江,包富山.共軛亞油酸的結(jié)構(gòu)、生理功能及來源[J].化學(xué)教育,2005(10):6-8

[2]Petersen B L.Influence of Capsularccharide-producing streptococcus Mozzarella cheese and cheese whey[J].Journal dairy science,2000,83(12):1952-1956

[3]高翔,鄭裴,馬海喬,等.乳酸菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)CLA功能性豆粕的研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2008,14(8):90-92

[4]張亞剛,樊莉,文彬,等.紫外可見分光光度法在共軛亞油酸定量分析中的應(yīng)用[J].新疆石油學(xué)院學(xué)報(bào),2002,6(2):59-63

[5]周凌華,張灝,鄭小平,等.共軛亞油酸紫外檢測(cè)方法的研究[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2007,5(126):267-270

[6]PARIZA M W,YANG X Y.Method of producing conjugated fatty acid:US:6060304[P].2000-05-09

[7]王中太,曹健,尹艷麗,等.共軛亞油酸的生物合成及相關(guān)酶基因的克隆與表達(dá)[J].化學(xué)與生物工程,2008,25(4):7-10

Increase the Conjugated Linoleic Acid Content of Water Milk by Fermentation

HUANG Yan,LU An-gen,YANG Yi-lin,MO Jian-guang
（Guangxi Center of Analysis and Test Research,Nanning 530022,Guangxi,China）

Adding different microbial strain to ferment water milk,applying solvent method to extracted CLA and than using BF3/Methanol for fatty acid methyl,to determine the CLA contents by UV Spectrophotometry and GC,and the results showed that,after screening of bacteria and fermenting,water milk's CLA content was increased,German lactobacillus subsp bulgaricus's conversion capability was better.

water milk;Conjugated linoleic acid;UV Spectrophotometry;GC

廣西壯族自治區(qū)直屬公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)課題（2009ACZ11）

黃艷（1982—），女（漢），工程師，碩士，長(zhǎng)期從事食品營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的檢測(cè)工作。

2011-12-19