張燕，閆磊，高文瑞，戴洋洋

（天津市乳品食品監(jiān)測中心，天津 300381）

高效液相色譜紫外熒光雙檢測器測定蔬菜中的克百威

張燕，閆磊，高文瑞，戴洋洋

（天津市乳品食品監(jiān)測中心，天津 300381）

建立一種測定農(nóng)產(chǎn)品中克百威含量的高效液相色譜法。樣品經(jīng)乙腈萃取后，提取液采用固相萃取技術分離、凈化，經(jīng)濃縮后，采用Symmetry C18色譜柱分離，流動相為甲醇:水=35:65（體積比），紫外檢測220 nm，標準曲線R=0.9999，最低檢出限為0.033 mg/kg；熒光檢測激發(fā)波長279 nm，發(fā)射波長307 nm，標準曲線R=0.9998，最低檢出限為1.6×10-3mg/kg。平均回收率分別為95.5%。

高效液相色譜；克百威；紫外檢測器；熒光檢測器

克百威屬高毒殺蟲劑。對眼睛和皮膚無刺激作用。在試驗劑量內(nèi)對動物無致畸、致突變、致癌作用。對魚、鳥高毒，對蜜蜂無毒害。適用范圍適用于水稻、棉花、煙草、大豆等作物上多種害蟲的防治，也可專門用作種子處理劑使用[1]。產(chǎn)品中克百威殘留的檢測標準都采用的是氣相色譜方法，使用氮磷檢測器分析。在采用該標準進行測定的過程中，發(fā)現(xiàn)氮磷檢測器對克百威靈敏度低，對于低濃度定量檢測困難，其檢出限達不到產(chǎn)品的限量要求。克百威在紫外區(qū)有一定的吸收[2]，檢測器上也可以得到良好的響應。本方法技術關鍵在于針對紫外檢測器和熒光檢測器，優(yōu)化色譜條件，提高方法靈敏度，同時要保持良好的重現(xiàn)性。對于較低濃度的克百威殘留，考慮用雙檢測器同時判定，共同定量，以提高方法的測定準確度。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

1.1.1 試劑

甲醇（色譜純或更高）；去離子水；乙腈（分析純或更高）；二氯甲烷（分析純或更高）；氯化鈉（分析純或更高）：140℃烘烤4 h。

1.1.2 材料

固相萃取柱，氨基柱，容量6 mL，填充物500 mg；濾膜：0.2 μm，0.45 μm；克百威：標準品，不少于 99%。

1.2 標準溶液配制

準確稱取一定量標準品，用甲醇稀釋，逐一配制成1000 mg/L的標準儲備液，貯存在-18℃以下冰箱中。使用時根據(jù)在檢測器上的響應值，吸取適量的標準儲備液，用甲醇稀釋配制成所需的標準工作液。

1.3 測試樣品

玉米，白菜，芹菜，紅薯。

1.4 儀器和設備

島津10A高效液相色譜儀（帶二級管陣列檢測器和熒光檢測器）、梅特勒分析天平（0.0001 g）。

1.5 方法提要及原理

樣品經(jīng)乙腈萃取后，提取液采用固相萃取技術分離、凈化，經(jīng)濃縮后，使用帶二級管陣列和熒光檢測器的高效液相色譜同時在線進行檢測，利用二級管陣列檢測器的光譜掃描定性，熒光檢測器定量。

1.6 測定步驟

1.6.1 提取

精確稱取樣品25.0 g試樣放入勻漿機中，加入50.0 mL乙腈，在勻漿機中高速勻漿2 min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有5 g～7 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，收集濾液40 mL～50 mL，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min，在室溫下靜置30 min，使乙腈相和水相分層。

1.6.2 凈化

從100 mL具塞量筒中準確吸取10.00 mL乙腈相溶液，放入150 mL燒杯中，將燒杯放在80℃水浴鍋上加熱，杯內(nèi)緩緩通入氮氣或空氣流，將乙腈蒸發(fā)近干；加入2.0 mL甲醇+二氯甲烷（1+99）溶解殘渣，蓋上鋁箔，待凈化。

將氨基柱用4.0 mL甲醇+二氯甲烷（1+99）預洗條件化，當溶劑液面到達柱吸附層表面時，立即加入上述待凈化溶液，用15 mL離心管收集洗脫液，用2 mL甲醇+二氯甲烷（1+99）洗燒杯后過柱，并重復一次，將離心管置于氮吹儀上，水浴溫度50℃，氮吹蒸發(fā)至近干，用甲醇準確定容至2 mL。在混合器上混勻后，用0.2 μm濾膜過濾，待測。

1.6.3 測定

分別取10 μL標準溶液和樣品待測液注入高壓液相色譜儀進行分析，得到組分的色譜峰。以保留時間和克百威標準光譜吸收曲線定性，用組分的色譜峰峰面積定量。

1.6.4 儀器條件

色譜柱：Symmetry C18柱，3.5 μm，4.6 mm×75 mm（或相當型號色譜柱）；流動相：甲醇+水（35+65）；流速：1.0 mL/min；紫外檢測器：波長220nm；熒光檢測器：激發(fā)波長279 nm，發(fā)射波長307 nm；進樣量：10 μL。

1.6.5 空白試驗

除不加式樣外，采用完全相同的測定步驟進行平行操作。

1.7 結(jié)果計算

試樣中克百威含量以X表示，單位為（mg/kg），按式（1）計算。

式中：S為式樣中克百威的峰面積；S0為標準溶液中克百威的峰面積；C0為標準溶液中克百威的濃度，（μg/mL）；V為樣液最終定容體積，mL；m為稱樣質(zhì)量，g；K 為稀釋倍數(shù)，5。

2 實驗結(jié)果

2.1 標準曲線

標準曲線見表1及圖1、圖2。

表1 克百威標準溶液濃度與峰面積Table 1 Carbofuran standard solution concentration and peak area

圖1 克百威不同濃度標準溶液與紫外檢測器峰面積線性關系Fig.1 Carbofuran different concentration of standard solution with UV detector linear relationship between peak area

圖2 克百威不同濃度標準溶液與熒光檢測器峰面積線性關系Fig.2 Carbofuran different concentration of standard solution and the fluorescence detector linear relationship between peak area

從圖1、2中可知，此紫外和熒光檢測器同時測得標準曲線的相關系數(shù)分別為R（UV）=0.9999和R（RF）=0.9998。

2.2 準確度

通過對玉米，白菜，芹菜，紅薯這4種樣品在不同濃度水平上（0.625、1.25、6.25 mg/kg）加標，回收率最低為86.8%，最高為112%，平均為95.5%，見表2。

表2 本方法測定4種樣品的回收率Table 2 The method for determination of three kinds of samples recovery rate %

2.3 精密度

經(jīng)過對4種陽性樣品（玉米，白菜，芹菜，紅薯）各15次平行測定得到數(shù)據(jù)的統(tǒng)計計算，4種陽性樣品（玉米，白菜，芹菜，紅薯）結(jié)果的變異系數(shù)分別為4.5%、1.1%、1.0%、4.8%，見表3。

表3 本方法測定4種陽性樣品15次平行實驗結(jié)果Table 3 The method for determination of four kinds of positive samples 15 parallel experiment m g/k g

2.4 檢出限

按照5009.1中色譜分析的檢出限計算方法，分別使用紫外和熒光檢測器的標準校正曲線計算出各自的檢出限：紫外法 3.3×10-2mg/kg，熒光法 1.1×10-3mg/kg，見表4及表5。

表4 紫外檢測器標準校正曲線計算出的檢出限Table 4 UV detector calibration curve to calculate the detection limit

表5 熒光檢測器標準校正曲線計算出的檢出限Table 5 Fluorescence detector calibration curve to calculate the detection limit

2.5 標準品紫外熒光兩種檢測器檢測紫外色譜圖

標準品紫外熒光兩種檢測器檢測紫外色譜圖，見圖3～4。

圖3 克百威標準品紫外色譜圖Fig.3 Carbofuran standard UV chromatogram

圖4 克百威標準品熒光色譜圖Fig.4 Carbofuran Standard fluorescence chromatogram

2.6 克百威標準品及陽性樣品二極管陣列檢測器

克百威標準品及陽性樣品二極管陣列檢測器（190nm～370 nm）紫外全波長掃描光譜圖，見圖5～6。

3 結(jié)論及討論

3.1 陽性的判定

通常現(xiàn)行測定克百威的國家、行業(yè)及其他標準液相方法中，對陽性結(jié)果判定的方法多為保留時間定性，由于樣品的繁雜會造成樣品中未知峰被誤判為陽性峰，出現(xiàn)假陽性。本方法通過加入對目標峰全波長掃描，使用標準光譜圖與目標峰光譜圖比對，從而可以準確定性，減少誤判。

3.2 靈敏度

圖5 克百威標準品紫外全波長掃描光譜圖Fig.5 Carbofuran standard ultraviolet wavelength scanning spectrum

圖6 陽性樣品紫外全波長掃描光譜圖Fig.6 Positive samples ultraviolet wavelength scanning spectrum

農(nóng)業(yè)部標準NY/T761-1997方法中測定克百威的檢出限2.5×10-3mg/kg，本實驗方法的最低檢出限可以達到1.6×10-3mg/kg，故在痕量殘留檢測時有一定的優(yōu)勢。

3.3 準確度和精密度

通過實驗數(shù)據(jù)可以看出，本實驗方法測定樣品加標有較好的回收，平行實驗也有穩(wěn)定結(jié)果，能夠滿足對蔬菜樣品檢測的要求。

[1]農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所.新編農(nóng)藥手冊[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1989:103-107

[2]李萍,王緒卿.肉及蛋類食品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥多組分殘留高效液相色譜分析[J].衛(wèi)生研究,2002,31(6):465-467

High-performance Liquid Chromatography Determination of UV Fluorescence Dual Detection of Carbofuran in Vegetables

ZHANG Yan,YAN Lei,GAO Wen-rui,DAI Yang-yang
（Dairy Food Monitoring Center,Tianjin 300381,China）

To establish a determination carbofuran in vegetables content by high performance liquid chromatography.Samples with acetonitrile extraction,extraction using solid phase extraction technique for the separation,purification,after concentration,using the Symmetry C18column,mobile phase of methanol:water=35:65(volume ratio).UV detection was 220 nm,standard curve R=0.9999.The lowest detection limit was 0.033 mg/kg.In the fluorescence detection,excitation wavelength was279nm and emission wavelength was307nm.Standard curve R=0.9998,the minimum detectable limit was 1.6×10-3mg/kg.The average recoveries were 95.5%.

high-performance liquid chromatography;Carbofuran;UV detection;fluorescence detection

張燕（1979—），女（漢），工程師，本科，研究方向：主要從事光譜和液相色譜儀器的應用和研究。

2011-12-30