王志偉

（上海質量監(jiān)督檢驗技術研究院，上海 200233）

不同沙門氏菌及干擾菌的分離鑒定

王志偉

（上海質量監(jiān)督檢驗技術研究院，上海 200233）

使用3種沙門氏菌（豬霍亂沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌）和2種干擾菌（弗氏檸檬酸桿菌和奇異變形桿菌）分別接種分離培養(yǎng)基，觀察生長和顯色情況。研究沙門氏菌和干擾菌在常規(guī)分離培養(yǎng)基BS、XLD、DHL、HE、BGA和顯色培養(yǎng)基CAS上的形態(tài)特征及生化試驗結果，比較分離鑒別效果。研究發(fā)現甲型副傷寒沙門氏菌具有延遲產H2S特性，弗氏檸檬酸桿菌和奇異變形桿菌均有產H2S現象，顯色培養(yǎng)基CAS的鑒別效果最好，BGA的分離鑒別效果最差。在實際檢測工作中，不能以是否產H2S作為鑒定沙門氏菌的唯一依據，利用顯色培養(yǎng)基可以顯著提高檢測效率和準確度。

沙門氏菌；干擾菌；分離培養(yǎng)基；顯色培養(yǎng)基

沙門氏菌是腸桿菌科中一種重要的人畜共患病原菌,不僅能導致雞白痢、雞傷寒、副傷寒、仔豬副傷寒、流產等多種動物疾病，而且在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌引起的中毒病例占首位或第二位[1]。引起沙門氏菌食物中毒最常見的是鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌，同時也可見于其他血清型的沙門氏菌[2]。根據國際慣例,要求對易受沙門氏菌污染的食品進行分類管理,以使大多數食物不含沙門氏菌,從而有效預防沙門氏菌病[3]。因此，沙門氏菌檢測已作為食品安全與質量檢測的重要指標。

就沙門氏菌的檢測方法而言，盡管目前已出現了免疫熒光標記法、酶聯(lián)免疫吸附法、核酸探針和以分子生物學為基礎的PCR法等快速沙門氏菌檢測技術，但在患者的治療和流行病學研究中，使用傳統(tǒng)的檢測方法分離到病原體是非常重要的，而且常規(guī)檢測方法仍然是目前國內外所普遍采用的標準方法。常規(guī)沙門氏菌的檢測方法主要包括預增菌、選擇性增菌、選擇和鑒別性平板分離培養(yǎng)、生化實驗和血清學分型鑒定等5個步驟。其中選擇性平板分離培養(yǎng)和生化實驗又是檢測過程中初步分離篩選沙門氏菌的重要環(huán)節(jié)。雖然沙門氏菌具有一些典型的生化反應特征，如不發(fā)酵乳糖、產生H2S等，但在實際的檢測操作中，往往由于干擾菌的影響和不同沙門氏菌之間存在的差異，進而影響了檢驗人員的判斷。文中主要對3種沙門氏菌及2種干擾菌在不同選擇分離平板上的生長顯色情況及生化實驗進行了分析研究。

1 材料與方法

1.1 標準菌株來源

豬霍亂沙門氏菌ATCC14028、鼠傷寒沙門氏菌AS1.1194、甲型副傷寒沙門氏菌CMCC50001、弗氏檸檬酸桿菌AS1.1732、奇異變形桿菌CMCC49005，以上菌株均由上海質量監(jiān)督檢驗技術研究院食化所微生物實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

亞硫酸鉍瓊脂（BS）、膽硫乳瓊脂（DHL）、酚紅煌綠瓊脂（BGA）、HE 瓊脂（HE）、XLD瓊脂（XLD）：均由OXOID公司提供；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基（CAS）：由法國科馬嘉公司（CHROMagar）提供；三糖鐵瓊脂（TSI）、尿素酶瓊脂（URE）、賴氨酸脫羧酶瓊脂（LIA）、蛋白胨水培養(yǎng)基（SAA）和營養(yǎng)肉湯（NB）：均由北京陸橋技術有限責任公司提供。所有培養(yǎng)基和試劑均在有效期內使用并通過了有效性驗證。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備

沙門氏菌常規(guī)分離培養(yǎng)基、顯色培養(yǎng)基及生化試驗所用培養(yǎng)基均按商品說明書制備。

1.3.2 研究用標準菌株的復蘇與接種

從5支標準菌株保藏管中各挑取一環(huán)菌苔，分別接到裝有5 mL營養(yǎng)肉湯的試管中，37℃培養(yǎng)16 h～20 h。將復蘇后的標準菌株分別劃線接種于沙門氏菌常規(guī)分離培養(yǎng)基和顯色培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24 h～48 h后觀察結果。從分離平板上挑取單個菌落分別接種于三糖鐵瓊脂（TSI）、尿素酶瓊脂（URE）、賴氨酸脫羧酶瓊脂（LIA）、蛋白胨水培養(yǎng)基（SAA）生化管中，37℃培養(yǎng)18 h～24 h后觀察結果。

2 結果

2.1 沙門氏菌和干擾菌在6種培養(yǎng)基上的生長和顯色情況

3種沙門氏菌在24 h～48 h內都在6種培養(yǎng)基上生長，結果見表1。豬霍亂沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌分別在24 h和48 h觀察結果，發(fā)現在不同分離平板上的生長情況大致相同，在BS、XLD、DHL、HE平板上均有黑色中心菌落產生，說明有H2S的產生；而甲型副傷寒沙門氏菌在24 h觀察結果時并未有明顯的H2S的產生，菌落不帶黑色中心，但在培養(yǎng)48 h后，菌落產生了明顯的的黑色中心，這說明甲型副傷寒沙門氏菌是延遲產H2S的。3種沙門氏菌在CAS顯色平板上均為紫紅色菌落。

表 1 3種沙門氏菌的菌株在不同培養(yǎng)基上的生長和顯色情況Table 1 The growth and color of three kinds of Salmonella strains in different media

2種干擾菌在24 h～48 h內都在6種培養(yǎng)基上生長，結果見表2。

表 2 2種干擾菌在不同培養(yǎng)基上的生長和顯色情況Table 2 The growth and color of two kinds of interfering bacteria in different media

弗氏檸檬酸桿菌在DHL分離平板上的形態(tài)特征與沙門氏菌相似，奇異變形桿菌在XLD和HE培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和沙門氏菌相似。弗氏檸檬酸桿菌在CAS顯色平板上為藍色菌落，可以和沙門氏菌明顯的區(qū)別開來。奇異變形桿菌在CAS顯色平板上則被抑制不生長。兩種干擾菌在BGA平板上均顯示出粉紅色菌落，這與沙門氏菌在BGA平板上的菌落顏色形態(tài)均一致，無法明顯區(qū)分。因此對比發(fā)現，顯色培養(yǎng)基CAS的選擇性最強，而BGA培養(yǎng)基的選擇性相對較差。

2.2 沙門氏菌和干擾菌的生化試驗情況

結果判定方法如下，H2S：TSI生化管中產生黑色為陽性、無黑色產生為陰性;URE：培養(yǎng)基變?yōu)榧t色為陽性，變?yōu)辄S色為陰性；LIA:上層呈紫色，下層呈淡紫色或全管紫色為陽性，黃色為陰性；SAA：加入靛基質試劑后產生紅環(huán)為陽性，無紅環(huán)產生為陰性。

3種沙門氏菌和2種干擾菌在生化管中培養(yǎng)18h～24 h的結果見表3。其中甲型副傷寒沙門氏菌的生化管延長培養(yǎng)至48 h。從表3可以看出，甲型副傷寒沙門氏菌的生化試驗中也出現了延遲產H2S現象；而弗氏檸檬酸桿菌和奇異變形桿菌的生化試驗中也均出現了產H2S現象；在3種沙門氏菌當中，唯有甲型副傷寒沙門氏菌的LIA反應為陰性。

表 3 生化試驗結果Table 3 Biochemical test results

3 結論

首先，通過比較發(fā)現，雖然產H2S是沙門氏菌的一個重要特征，但并不是唯一判定標準，在實際檢測工作中并不能以此為依據簡單的進行沙門氏菌的篩選。例如腸桿菌科中弗氏檸檬酸桿菌和奇異變形桿菌的產H2S現象就是很好的證明，如果食品中同時存在著這些干擾菌，在沙門氏菌的檢測中就應該加大注意，盡可能多的挑取可疑菌落進行后續(xù)測試，結合生化試驗來分析判斷。如果有條件的話，可以用顯色培養(yǎng)基來分離沙門氏菌。通過對比不難發(fā)現，干擾菌在顯色培養(yǎng)基上呈現藍色或被抑制不生長，而沙門氏菌在其上顯現出特殊的紫紅色，這樣可以顯著提高檢測效率和準確度。

其次，甲型副傷寒沙門氏菌與典型的豬霍亂沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌也有一些不同，無論是在分離培養(yǎng)基上的形態(tài)或是生化試驗結果。尤其值得注意的是甲型副傷寒沙門氏菌的延遲產H2S現象，因此，在實際檢測中，分離平板的培養(yǎng)時間應掌握好，必要時可延長培養(yǎng)時間，一般培養(yǎng)48 h左右再觀察，減少誤判，防止產生假陰性結果。

最后，在進行沙門氏菌的生化試驗鑒定中，同樣也不能以是否產H2S作為唯一判定標準，應結合其他反應綜合判斷。只有出現TSI反應是斜黃底黃，同時LIA反應為陰性的情況下才可以排除沙門氏菌的可能性[4]。另外一個需要注意的甲型副傷寒沙門氏菌的LIA反應結果為陰性，這與一些文獻中提到的甲型副傷寒沙門氏菌是沙門菌屬中唯一賴氨酸脫羧酶陰性的菌型相符合[5-6]。

綜上所述，由于食品中存在大量非沙門氏菌的干擾菌，而且不同的沙門氏菌之間也存在著差異，因此在實際檢測工作中一方面應科學客觀的判斷測試結果，同時使用幾種不同的分離鑒別培養(yǎng)基進行檢測，對于可疑的菌落，應結合生化試驗綜合判斷；另一方面可以采用具有較高敏感性和特異性的顯色培養(yǎng)基來分離沙門氏菌[7]，提高檢測效率和準確度，減少誤判。

[1]王章云.腸炎沙門氏菌引起的食物中毒細菌學調查[J].中國人畜共患病雜志,1999,15(3)：115

[2]趙月蘭，秦建華.沙門氏菌對動物性食品的污染與檢測[J].張家口農專學報，1995，11(4)：40

[3]彭麗萍,陳博文.食品沙門氏菌檢測方法進展[J].中國人獸共患病雜志,1999,15(5):89-91

[4]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB4789.4-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2010：4

[5]何曉青.衛(wèi)生防疫細菌檢驗[M].南昌：新華出版社,1989:175-185

[6]Krieg N R,Brenner D J,Staley J T.Bergey's Manual of Systematic Bacteriology[M].Baltimore/London：Williams and wilkins，1984:408-516

[7]陳茂義，胡婕，劉建昭，等.科馬嘉顯色培養(yǎng)基和XLD、SS、HE分離食品中沙門菌效果比較[J].公共衛(wèi)生與預防醫(yī)學，2008，19(4)：14

Isolation and Identification to Different Salmonellas and Interference Strains

WANG Zhi－wei
（Shanghai Institute Quality Inspection and Technical Research，Shanghai 200233，China）

Threekinds of Salmonellas（Salmonellacholeraesuis，Salmonellaty phimurium，Salmonella paratyphi）and two kinds of interference strains（Citrobacter freundii and Proteus mirabilis）were inoculated in isolation medium to observe the growth and color situation.This summary intend to research morphological characteristic of Salmonellae and interference strain in BS，XLD，DHL，HE，BGA and the Chromogenic Medium and biochemical test results.Salmonella paratyphi has delayed production H2S and Citrobacter freundii and Proteus mirabilis have produced H2S.The identification effect of CAS medium is the best，BGA has the worst separation effect.Producing H2S can not be the sole criteria for identification of Salmonella，the using of chromogenic media can significantly improve the detection efficiency and accuracy.

Salmonellae；interference strain；isolation medium；CHROM agar medium

王志偉（1980—），男（漢），助工，碩士，研究方向：食品中致病菌檢測。

2011-07-17