閆佳，李躍萍，閆慶峰，韋祎

（海南醫(yī)學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，海南 ?？?571101）

我國(guó)是肉類生產(chǎn)大國(guó)，冷卻肉是指嚴(yán)格執(zhí)行獸醫(yī)檢疫制度屠宰后的畜禽胴體迅速進(jìn)行冷卻處理，使胴體溫度（以后腿肉中心為測(cè)量點(diǎn)）在24 h內(nèi)降為0℃～4℃，并在后續(xù)加工、流通和銷售過(guò)程中始終保持0℃～4℃范圍內(nèi)的生鮮肉，它比冷凍肉具有更佳的口感與營(yíng)養(yǎng)。因此冷卻肉貨架期引起人們關(guān)注。決定冷鮮肉貨架期和微生物安全性的主要因素是原料肉初始菌數(shù)及其保鮮處理方式。表面減菌化處理常用的天然保鮮劑有木犀草素、茶多酚及各種植物的提取物等[1]。

茶多酚是一類以兒茶素為主體的多羥基的酚類物質(zhì)，有抗脂質(zhì)氧化和抑菌的作用[2]，木犀草素也有抑菌抗氧化作用[3]。山苦茶是海南民間的一種具有濃郁地方特色和民族特色的代茶飲料植物和重要的藥用植物[4]，有抗菌和抗病毒作用。根據(jù)柵欄技術(shù)，將這3種天然防腐劑有效組合，探索延長(zhǎng)冷卻肉保質(zhì)期的技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌：假單胞菌、乳酸菌、熱死環(huán)絲菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌。

生物防腐劑為茶多酚，木犀草素，山苦茶浸出物（在海南茶葉店購(gòu)買山苦茶100 g，50目粉碎后，采用茶∶純凈水=1∶100（g∶g），用 85 ℃純凈水浸泡 30 min，用抽濾機(jī)過(guò)濾，合并3次浸提茶湯，減壓濃縮并烘干，得5 g山苦茶浸出物，裝瓶，低溫4℃冷藏）。

主要設(shè)備為DHP-9052恒溫培養(yǎng)箱、BPH-9050A鼓風(fēng)干燥箱：上海申賢恒溫設(shè)備廠；BCD-268WBCS冰箱：海爾；JB-FY-900/900U超凈工作臺(tái)：蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；DK-400S真空封口機(jī)：深圳市安德利包裝設(shè)備有限公司；濾紙圓片（打孔器將厚1.5 mm厚濾紙打成直徑6 mm圓片）、康威氏皿等。

1.2 方法

1.2.1 天然防腐劑制備

將茶多酚、木犀草素、山苦茶浸出物用無(wú)菌蒸餾水配成不同濃度備用。

1.2.2 濾紙片法

濾紙片法實(shí)驗(yàn)步驟：將厚度1.5 mm直徑6 mm圓片包裝后160℃干熱滅菌2 h；將各供試菌的選擇性培養(yǎng)基倒入干熱滅菌后的培養(yǎng)皿內(nèi)，凝固后使用；在無(wú)菌室里挑培養(yǎng)的菌落放入10 mL無(wú)菌蒸餾水中，磁力攪拌均勻，成為含菌106cfu/mL～107cfu/mL的菌懸液；用滅菌后的吸管吸0.2 mL各供試菌懸液于平皿內(nèi)，用無(wú)菌三角玻璃棒將其涂勻；將濾紙片放入茶多酚、山苦茶浸出物、木犀草素的不同濃度液中浸泡1 min，取出甩干貼于平板上。各平皿放6個(gè)（同一抑菌液不同濃度5個(gè)和空白對(duì)照組）濾紙片，每種抑菌液做3個(gè)平板重復(fù)；將平皿倒置放于恒溫箱中，按各菌的最適培養(yǎng)溫度培養(yǎng)24 h；用測(cè)微尺測(cè)各抑菌圈大小。

1.2.3 抑菌能力測(cè)定

采用濾紙片法測(cè)定抑菌圈直徑，抑菌圈直徑6mm表示無(wú)抑菌能力（-），6mm～10mm 抑菌力弱（+），10 mm～12 mm抑菌力較強(qiáng)（++），12 mm以上抑菌力強(qiáng)（+++）。

1.2.4 肉樣處理

用75%酒精棉球擦刀具和面板，將購(gòu)回的冷卻肉分別去筋膜，切成100 g的肉塊，隨即分為20組，每組3塊。將其放入以蒸餾水為溶劑的按設(shè)計(jì)安排的實(shí)驗(yàn)組配制各組保鮮液中及空白對(duì)照（無(wú)菌蒸餾水）浸泡1 min，取出自然濾干2 min～3 min，采用聚偏氯乙烯真空包裝袋，真空包裝后，貼上標(biāo)簽，放入0℃～4℃冰箱中貯藏定期測(cè)細(xì)菌總數(shù)和TVB-N值。

1.2.5 細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定

按GB/T 4789.2-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行。

1.2.6 TVB-N（揮發(fā)性鹽基氮）的測(cè)定

按GB/T 5009.44-2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種天然防腐劑的抑菌圈直徑和抑菌力

冷卻肉上幾大類菌所占比例基本一致，假單胞菌屬占25%～26%，乳酸菌20%～21%，熱死環(huán)絲菌占12%～13%，葡萄球菌屬和微球菌占12%～15%，酵母菌和霉菌占5%～6%，腸桿菌科差異較大在19%～26%之間。冷卻豬肉中初始菌相包括假單胞菌、乳酸菌、熱死環(huán)絲菌、腸桿菌科、葡萄球菌屬、微球菌屬及少量酵母菌。其中以假單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)[5]。

本實(shí)驗(yàn)里，3種天然防腐劑分別對(duì)假單胞菌、乳酸球菌、熱死環(huán)絲菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌抑菌力分別見(jiàn)表1。

表1 3種天然防腐劑對(duì)5種腐敗菌的抑菌力Table 1 The antimicrobial strength of different preservatives on spoilage bacteria

2.2 復(fù)合保鮮液模型的建立與統(tǒng)計(jì)分析

因?yàn)槊糠N天然防腐劑的抑菌譜不一致，單一食品防腐劑不能有效地抑制和殺滅所有微生物。根據(jù)柵欄技術(shù)的原理，將不同種類天然防腐劑按一定比例混合，發(fā)揮其協(xié)同作用，增強(qiáng)其抑菌效果，降低單一防腐劑的用量，達(dá)到綜合保鮮的目的。

結(jié)合前面3種天然防腐劑采用濾紙片法實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，將茶多酚、木犀草素、山苦茶浸出物三因素，采用三因子二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的因素水平編碼見(jiàn)表2。表3的Y值采用細(xì)菌總數(shù)抑菌率。

表2 因素水平編碼表Table 2 The facter levels of design

對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的抑菌率求平均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)三因子二次通用旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)軟件WHG52對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果如下：偏回歸系數(shù)B（1）＝0.528 B（2）＝0.637 B（3）＝0.4959 偏回歸系數(shù) F 測(cè)驗(yàn)表明F（1）=9.19*、F（2）=11.03**、F（3）=6.68*、失擬檢驗(yàn) F=0.98、擬和檢驗(yàn) F2=4.30*，回歸方程 Y=86.13-0.233X12+0.068X22+0.510X32+0.582X1+0.637X2+0.496 X3-0.188 X1X2-0.238 X1X3-0.188 X2X3。

對(duì)此方程進(jìn)行F檢驗(yàn)得出失擬檢驗(yàn)差異不顯著，擬和檢驗(yàn)差異顯著。失擬檢驗(yàn)不顯著，說(shuō)明本設(shè)計(jì)所考慮的因子足以反映3種保鮮劑對(duì)豬肉中腐敗菌抑菌效果的影響，不存在不可忽視的因子，擬和檢驗(yàn)差異顯著，說(shuō)明此回歸方程在本實(shí)驗(yàn)中有意義。此回歸設(shè)計(jì)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了中心標(biāo)準(zhǔn)化，消除了量綱上的差異，可以直接從回歸系數(shù)絕對(duì)值的大小來(lái)分析各因子對(duì)豬肉中腐敗菌抑菌效果的影響力。從回歸方程可知，3個(gè)一次項(xiàng)回歸系數(shù)絕對(duì)值大小依次為B2B1B3，說(shuō)明茶多酚對(duì)抑菌效果影響最大。通過(guò)各回歸系數(shù)進(jìn)行F檢驗(yàn)可知，3種保鮮劑對(duì)樣品的抑菌效果均有顯著影響（P<0.05）。

表3 3種防腐劑因素水平碼值表和試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The factors quadratic design of three preservatives andresult

得出3種保鮮劑的最佳添加量組合是：木犀草素0.010%、茶多酚0.125%、山苦茶浸出物0.013%。

2.3 最佳組合保鮮劑處理的豬肉在冷藏期間細(xì)菌總數(shù)變化和TVB-N值的變化

將添加量為木犀草素0.010%、茶多酚0.125%、山苦茶浸出物0.013%的最佳組合保鮮液按1.2.4的方法處理肉樣，真空包裝后，0～4℃貯藏，定期測(cè)定細(xì)菌總數(shù)和TVB-N值。

圖1 不同處理貯藏過(guò)程中細(xì)菌總數(shù)變化Fig.1 The changes of the total bacteria counts of different treat

圖2 不同處理貯藏過(guò)程中TVB-N變化Fig.2 The changes of the TVB-N value of different treat

肉的腐敗變質(zhì)主要是由于細(xì)菌繁殖以及酶作用的結(jié)果，造成蛋白質(zhì)被分解而產(chǎn)生氨及胺類等堿性含氮物質(zhì)，通過(guò)測(cè)定細(xì)菌總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮的生成量，可判斷肉的新鮮度[6]。國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：當(dāng)肉的TVB-N值大于25 mg/100 g，細(xì)菌總數(shù)大于108cfu/g，為腐敗肉[7]。

從圖1和圖2可以看出，組合保鮮劑處理的豬肉在0℃～4℃冷藏期間細(xì)菌總數(shù)和TVB-N值明顯均低于對(duì)照組。各組在0℃～4℃貯藏的前9天處于緩慢上升狀態(tài)，之后逐漸變快。原因主要是原料肉的初始菌數(shù)較低，再加上保鮮液的抑菌作用，使引起冷卻肉腐敗的細(xì)菌不能快速生長(zhǎng)繁殖而分解蛋白質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)測(cè)定得出0℃～4℃冷藏，對(duì)照組保鮮期為20d，組合保鮮劑處理組保鮮期為26 d，說(shuō)明：木犀草素0.010%+茶多酚0.125%+山苦茶浸出物0.013%組合保鮮劑對(duì)對(duì)冷卻豬肉進(jìn)行表面減菌化處理能有效控制微生物增值，延緩肉的腐敗變化速度。

3 結(jié)論

首先測(cè)定山苦茶浸出物、茶多酚、木犀草素3種天然防腐劑對(duì)冷卻肉中常見(jiàn)菌的抑菌效果，根據(jù)柵欄技術(shù)，發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，利用三因子二次正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)，確定最佳的保鮮液配比為木犀草素0.010%+茶多酚0.125%+山苦茶浸出物0.013%。用此保鮮液浸泡肉樣1 min，取出自然濾干2 min～3 min，用聚偏氯乙烯真空包裝袋真空包裝后，放入0℃～4℃冰箱中，通過(guò)測(cè)定在冷藏過(guò)程中肉樣的細(xì)菌總數(shù)、TVB-N，表明了此保鮮液與對(duì)照組相比，對(duì)冷肉的保質(zhì)期可延長(zhǎng)6 d。

[1]王金枝,孔保華,刁新平.冷卻肉保鮮的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2004(5):66-67

[2]陶榮達(dá).茶多酚的制備和應(yīng)用研究的進(jìn)展[J].化學(xué)世界,1997(2):64-67

[3]陳春濤.花生殼中木犀草素等抑菌活性成分的提取、純化與研究[J].食品科學(xué),2003,24(5):85

[4]林海,麥光大,唐小山,等.山苦茶的抗菌和抗病毒作用研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1993,24(3):235

[5]Leistner L.Food preservation by combined methods[J].Food research international,2002,125(6):151

[6]吳信法.畜產(chǎn)食品獸醫(yī)衛(wèi)生檢驗(yàn)手冊(cè)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1998:114

[7]金鋪建.肉類加工企業(yè)的衛(wèi)生管理[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1993:82