尚天翠，劉影，衛(wèi)剛

（1.伊犁師范學(xué)院化學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，新疆 伊寧 835000；2.新疆伊寧衛(wèi)生學(xué)校專業(yè)基礎(chǔ)學(xué)科，新疆 伊寧 835000）

乳酸細(xì)菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸而多數(shù)不能分解蛋白質(zhì)的革蘭氏陽性細(xì)菌的統(tǒng)稱。這類細(xì)菌在自然界分布極為廣泛，與人類生活有著密切的關(guān)聯(lián)。多數(shù)有益乳酸菌在其發(fā)酵食品及產(chǎn)物中不形成任何毒素或有毒產(chǎn)物，產(chǎn)生乳酸及一些芳香物質(zhì)而直接提高發(fā)酵食品的營養(yǎng)價值和可口性。

伊犁哈薩克自治州地區(qū)制作乳酸發(fā)酵奶食品的資源非常豐富，并且有傳統(tǒng)的制作經(jīng)驗(yàn)。該區(qū)的少數(shù)民族，如哈薩克族和維吾爾族以牛乳、羊乳、馬乳和駱駝乳等為原料，采用傳統(tǒng)工藝加工各種發(fā)酵乳制品，產(chǎn)品的加工方法雖然比較簡單，但風(fēng)味純真獨(dú)特，這與該區(qū)特殊的自然環(huán)境以及其中分布的微生物種群有著密切關(guān)系，因此，探明這一地區(qū)乳酸菌的種類十分必要。本文對伊犁地區(qū)的乳及乳制品樣品進(jìn)行了采集，并進(jìn)行了乳酸菌的分離、鑒定和詳細(xì)生物學(xué)特性的研究，旨在為開發(fā)利用這一地區(qū)特有的乳酸菌資源，促進(jìn)該區(qū)乳制品工業(yè)的發(fā)展提供參考，同時，也為微生物生態(tài)學(xué)積累資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

2009年4月采集伊犁哈薩卡自治州伊犁昭蘇牧場酸駝奶（編號ST），伊犁伊寧縣駝奶（編號TO），伊犁果子溝酸牛奶（編號SN）和伊寧市牛奶（編號NO）各1份。樣品存放于滅菌采樣瓶中，置于冰盒中4℃存放，直至運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

德氏乳桿菌保加利亞亞種（L.delbrueckii subsp.bulgaricus.CGMCC 1.1863）、乳酸乳球菌乳酸亞種（L.1actis subsp.lactis.CGMCC 1.1936）、腸膜明串珠菌葡聚糖 亞 種 （L.mesentaroids subsp.dextranicum.CGMCC 1.17）：購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、BCP培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基按文獻(xiàn)[1-2]的方法配制；而其他生理生化試驗(yàn)和糖類發(fā)酵試驗(yàn)用培養(yǎng)基和試劑等均按文獻(xiàn)[2-5]的方法配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的計數(shù)及分離

將乳品經(jīng)過溫度、pH測定后，進(jìn)行乳酸菌的分離和純化：將乳品用滅菌生理鹽水10倍遞增稀釋至10-4、10-5兩個稀釋度。乳酸菌計數(shù)采用傾注法[6]。

將乳品10-4、10-5稀釋液用滅菌接種環(huán)劃線接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h～72 h，然后挑取有透明環(huán)的單個菌落，接種到MRS瓊脂培養(yǎng)基和BCP培養(yǎng)基上純培養(yǎng)，純化后再接種到MRS瓊脂培養(yǎng)基和BCP培養(yǎng)基培養(yǎng)后，置4℃冰箱中保存、備用[7]。

1.2.2 菌株的形態(tài)、染色特性及菌落特性觀察

觀察培養(yǎng)后的乳酸菌的形態(tài)和培養(yǎng)特征并記錄。

取各種單菌落涂片，用革蘭氏染色法染色，在顯微鏡下觀察，記錄其形態(tài)特征，并進(jìn)行顯微照相。

1.2.3 乳酸菌的鑒定及其生物學(xué)特性的研究

根據(jù)文獻(xiàn)[6，8-9]，革蘭氏陽性，過氧化氫酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、聯(lián)苯胺反應(yīng)試驗(yàn)等為陰性，在MRS平板培養(yǎng)基上菌落周圍形成明顯的透明環(huán)的所有分離菌，均初步鑒定為乳酸菌（桿菌或球菌）。在確定為乳酸菌的前提下，進(jìn)一步進(jìn)行明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、產(chǎn)生硫化氫試驗(yàn)、不同pH培養(yǎng)試驗(yàn)、不同溫度培養(yǎng)試驗(yàn)、耐鹽性試驗(yàn)、美藍(lán)還原試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)等試驗(yàn)，將乳酸菌屬分離菌株鑒定到種。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的計數(shù)和分離

伊犁地區(qū)乳品中乳酸菌的計數(shù)與分離結(jié)果見表1。

表1 乳酸菌的計數(shù)和分離Table 1 Counting and isolation of lactic acid bacteria

從表1可以看出，乳酸菌數(shù)量在6.48×107mL-1～1.12×109mL-1之間，并且4種乳樣中共分離出10株乳酸菌，其中桿菌4株、球菌4株、明串珠菌2株。并且從表中我們還可以看出，酸駝奶和酸牛奶中乳酸菌的種類明顯高于其他樣品。

2.2 乳酸菌菌株的形態(tài)、菌落特性及染色特性

2.2.1 乳酸菌菌株的形態(tài)及菌落特性

本研究分離的菌株在MRS培養(yǎng)基上生長48 h后，菌落外周形成大小不同的透明區(qū)，而在BCP培養(yǎng)基上生長后，菌落周圍的顏色由藍(lán)紫色變成黃色[5]。從培養(yǎng)好的平板中，挑取10個不同的單菌落，逐個編號，根據(jù)菌落識別要點(diǎn)，識別乳酸菌的培養(yǎng)特征結(jié)果見表2。

表2 未知乳酸菌菌落的形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of unknow lactic acid bacteria

從表2可以看出，分離的桿菌在MRS培養(yǎng)基上形成圓形光滑、比較厚、大小0.5 mm～3 mm左右的乳白色、表面光滑、邊緣整齊、透明隆起的菌落，如ST3，SN2，NO2，TO1。

分離的球菌在MRS培養(yǎng)基上形成圓形光滑、比較薄、大小0.5 mm～2 mm左右的乳白色、表面光滑、邊緣整齊、透明扁平的菌落，如 ST1，ST2，ST4，SN1，NO1，TO2。

2.2.2 乳酸菌菌株的染色特性

分離的菌株經(jīng)革蘭氏染色，用E221LED型光學(xué)顯微鏡放大40倍觀察結(jié)果為：呈革蘭氏染色陽性，有單個、成對或鏈狀排列的短或長桿菌以及單個、成對或鏈狀排列的球狀菌或桿狀菌，如圖1。

2.3 乳桿菌屬種（Lactobacillus）的鑒定結(jié)果及其生物學(xué)特性

乳桿菌屬種的鑒定結(jié)果見表3、表4。

圖1 各種乳酸菌的形態(tài)觀察Fig.1 Morphologic observation of different lactic acid bacteria

表3 乳酸菌的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria

表4 乳酸菌糖發(fā)酵試驗(yàn)鑒定結(jié)果Table 4 Fermentation characteristics of lactic acid bacteria

表3、表4中所列的4株革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、聯(lián)苯胺試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、H2S產(chǎn)生試驗(yàn)和明膠液化試驗(yàn)中呈陰性，均不運(yùn)動，能在pH為4.5中生長的桿狀菌株鑒定為乳桿菌屬的細(xì)菌。被鑒定的4株菌的共同特點(diǎn)是都能在10℃和45℃條件下生長，不產(chǎn)生氨的同型發(fā)酵型菌株。菌株ST3、SN2、NO2、TO1能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖等單糖，也能發(fā)酵蔗糖、纖維二糖、果糖等雙糖，能利用松三糖，不能發(fā)酵鼠李糖，乳酸旋光性為DL，因此為干酪乳桿菌假植物亞種（L.casei subsp.Plantaman）。以上4株菌在45℃均能生長，都有耐熱性，不能耐受pH6.5的NaCl，但對pH9.6的NaOH有耐受性，可被0.1%美藍(lán)還原。

2.4 球形乳酸菌屬的鑒定結(jié)果及生物學(xué)特性

上述分離到的6株球菌，進(jìn)行了硝酸鹽還原試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、聯(lián)苯胺試驗(yàn)、明膠液化等生理生化反應(yīng)試驗(yàn)，最終將6株菌株歸屬于下列3個屬，見表3。

2.4.1 腸球菌屬種（Enterococcus）的鑒定結(jié)果及其生物學(xué)特性

表3、表4中，ST1，SN1菌株在過氧化氫酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、聯(lián)苯胺試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氫酶試驗(yàn)均為陰性，在10℃和45℃都生長的革蘭氏陽性球狀菌，鑒定為腸球菌屬的細(xì)菌。這兩株菌均能在pH9.6和6.5%NaCl環(huán)境中生長，均能還原0.1%美藍(lán)，能水解精氨酸，將能分解木糖、棉子糖、蜜二糖，對阿拉伯糖有一定分解能力的ST1菌株鑒定為雞腸球菌（E.gallins.rum）；將能利用檸檬酸鹽，而不利用鼠李糖、山梨醇的SN1菌株鑒定為屎腸球菌（E.faecium）。

2.4.2 乳球菌屬種（Lactococcus）的鑒定結(jié)果及其生物學(xué)特性

在表3、表4中，ST2，NO1菌株在10℃和40℃都生長，在45℃不生長，不能在6.5%NaCl環(huán)境中生長，能還原0.1%美藍(lán)，不運(yùn)動，能耐受pH9.6的堿性環(huán)境，精氨酸不產(chǎn)氨，能分解蔗糖和麥芽糖，不能利用蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露糖醇、山梨醇，因此將這兩菌株鑒定為乳酸乳球菌乳酸亞種（L.lactissubspcremoris）。

2.4.3 明串珠菌屬種（Leuconostoc）的鑒定結(jié)果及其生物學(xué)特性

表3、表4中所列的ST4，TO2菌株，革蘭氏染色為陽性，球狀成對或鏈狀排列，在過氧化氫酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、聯(lián)苯胺試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氫酶試驗(yàn)、產(chǎn)氨試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇（V.P.）試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)均為陰性，發(fā)酵葡萄糖既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，可液化明膠，不水解精氨酸，不產(chǎn)生吲哚和硫化氫，在25、40、45℃均能生長但在10℃時不生長，能利用多種單糖、雙糖、多糖，但對鼠李糖、棉子糖、松三糖和蜜二糖的利用能力較弱，因此這兩菌株暫定為腸膜明串珠菌腸膜亞種（Lc.Mesenteroides subsp.Mesenteroides）。

3 結(jié)論與討論

對伊犁地區(qū)牧民家庭中采集的乳品中的乳酸菌進(jìn)行了分離和鑒定。結(jié)果表明：從4份樣品中共分離到乳酸菌10株，并進(jìn)行了種的鑒定，分到干酪乳桿菌假植物亞種（L.casei subsp.Plantaman）4 株、雞腸球菌（E.gallins.rum）1 株、屎腸球菌（E.faecium）1 株、乳酸乳球菌乳酸亞種（L.lactis subsp.cremoris）2株、腸膜明串珠菌腸膜亞種（Lc.Mesenteroides subsp.Mesenteroides）2株。

所分離菌株均為中溫菌，即10℃生長，40℃生長良好，其中 ST1、ST3、ST4、NO2、TO1、TO2、SN1、SN2 等8株在10℃和45℃培養(yǎng)均能良好生長。從生長溫度結(jié)果看，乳球菌、腸球菌在10℃～45℃范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，而明串珠菌在20℃～30℃（或稱室溫）環(huán)境下具有良好的生長特性。這表明，所分離菌株具有適應(yīng)于該地區(qū)多變的氣候和室內(nèi)外溫度等環(huán)境的能力。而且該地區(qū)乳酸菌微生態(tài)關(guān)系也較多樣化，有單生，也有共生、互生和拮抗等現(xiàn)象。如：ST1，ST2，ST3與ST4、SN1與SN2、NO1與NO2、TO1與TO2為共生菌。乳酸菌微生態(tài)關(guān)系的探明對于不同菌株的功效解析有一定意義。如果將本項(xiàng)分離菌株合理組合，會得到具有獨(dú)特風(fēng)味的更好的新的乳制品。本次研究主要采用乳酸菌生理生化指標(biāo)特性的表型鑒定方法，所以，鑒定試驗(yàn)結(jié)果個別菌株有些項(xiàng)目與標(biāo)準(zhǔn)不符。因此，更詳細(xì)的歸屬研究分析有待結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)一步進(jìn)行。

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