王玉，吳疆，吳家鑫

（1.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)系，天津 300384；2.中牧實業(yè)股份有限公司獸藥研究所，北京 100091）

乳酸是世界上公認的三大有機酸之一，是重要的生物化工產(chǎn)品，在醫(yī)藥、食品等工業(yè)有廣泛的應(yīng)用[1]。它也是制造無毒的高分子化合物聚L-乳酸的單體，且聚L-乳酸具有良好的生物相容性，強度高，可塑性加工成型，不污染環(huán)境因而被認為是最有前途的可生物降解高分子材料[2]。在乳酸發(fā)酵工業(yè)中，利用高溫乳酸菌可以縮短生產(chǎn)周期、節(jié)約冷卻用水，減少污染的可能性。

本文將Plackett-Burman設(shè)計與Box-Benhnken設(shè)計相結(jié)合，并運用SAS軟件對一株能夠耐受55℃高溫的乳酸菌發(fā)酵乳酸的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化。

1 儀器、材料與方法

1.1 儀器

飛鴿牌系列離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；生化培養(yǎng)箱（55℃）：江蘇金壇市宏凱儀器廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；電子天平：梅特勒－托利多儀器(上海）有限公司；旋轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；生物傳感分析儀SBA-40C：山東省科學(xué)院。

1.2 耐高溫乳酸菌LA-55

由天津農(nóng)學(xué)院微生物實驗室篩選保藏。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 50、蛋白胨 10、酵母膏5、牛肉膏 10、乙酸鈉 5、MgSO4·2H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.038、檸檬酸二胺 2、K2HPO42、CaCO317，pH6.5。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 30、蛋白胨 10、酵母膏10、牛肉膏 10、乙酸鈉 5、MgSO4·2H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.2、檸檬酸二胺 2、K2HPO40.2、CaCO320、吐溫 801，pH6.8。

發(fā)酵培養(yǎng)基：初始發(fā)酵培養(yǎng)基同種子培養(yǎng)基，在優(yōu)化實驗中，各成分的量隨設(shè)計的不同而不同。

1.4 實驗方法

1.4.1 L-乳酸的發(fā)酵

將斜面3～4環(huán)接于裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，55℃下120 r/min培養(yǎng)12 h即為種子液。以10%（體積比）的接種量接種于裝50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，55℃，120 r/min搖床培養(yǎng)36 h。發(fā)酵培養(yǎng)基成分根據(jù)實驗方案逐次改變。

1.4.2 分析方法

采用生物傳感分析儀。

1.4.3 Plackett-Burman設(shè)計

采用Plackett-Burman設(shè)計可以在多種因素存在的條件下評價各因素之間的相對重要性[3]。選用實驗次數(shù)N=12的實驗設(shè)計，對9個因素進行考察，各因素對應(yīng)的水平取值見表1。

表1 Plackett-Burman實驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design g/L

1.4.4 Box-Benhnken設(shè)計

Box-Benhnken中心組合設(shè)計是比較常用的響應(yīng)面分析法（RSA）方法，適用于2至5個因素的優(yōu)化實驗[4]。本實驗在P-B實驗的基礎(chǔ)上，以乙酸鈉，酵母膏，蛋白胨3個因素為自變量，設(shè)計了三因素三水平響應(yīng)面分析實驗。各自變量的編碼值如表2所示。

表2 Box-Benhnken設(shè)計因素水平編碼表Table 2 Factors and levels of Box-Benhnken design g/L

2 結(jié)果與分析

2.1 L-乳酸發(fā)酵主要影響因素的確定

采用Plackett-Burman實驗對前期實驗篩選出的氮源、碳源和無機鹽進行優(yōu)化，選出對L-乳酸發(fā)酵有重要影響的因素，實驗方案及結(jié)果見表3。

表3 Plackett-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 The results of Plackett-Burman design

通過SAS軟件對實驗結(jié)果進行分析，各因素主效應(yīng)分析結(jié)果見表4。

表4 各因素的主效應(yīng)Table 4 Main effect of the factors

乙酸鈉在α=0.1水平上對L-乳酸產(chǎn)量有顯著影響，其他因素均不顯著。綜合實驗分析，選擇排在前三位的乙酸鈉、酵母膏、蛋白胨進行下一步實驗。

2.2 最適灰樹花胞外多糖發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

2.2.1 Box-Benhnken實驗設(shè)計及分析

依據(jù)P-B實驗和最陡爬坡實驗確定的實驗因素與水平，采用Box-Benhnken實驗設(shè)計對產(chǎn)灰樹花發(fā)酵條件進行三因素三水平的響應(yīng)面分析實驗，實驗結(jié)果見表5。

運用SAS軟件的RSREG（響應(yīng)面回歸）過程對數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合見表6、表7。由表6可知，該回歸模型顯著，復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.9210，因此通過SAS軟件分析得出的此回歸方程擬合程度較好。方差分析說明，各因素的一次項、二次項顯著影響L-乳酸合成，說明響應(yīng)面分析所選的3個因素（乙酸鈉、酵母膏、蛋白胨）主效應(yīng)顯著。失擬檢驗Pr=0.5038，不顯著，說明不需要引入更高次項，模型中無異常點，模型規(guī)定恰當(dāng)。擬合的二次回歸方程為：

表5 Box-Benhnken實驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 The results of Box-Benhnken design

表6 方差分析表Table 6 The results of variance analysis

表7 回歸模型系數(shù)估計Table 7 Estimated value of the regression coefficient

2.2.2 響應(yīng)面直觀分析

根據(jù)模型方程（回歸方程）可以作出響應(yīng)曲面圖及其等高線圖。它們可以比較直觀地解釋各變量和變量之間對響應(yīng)值的影響。圖1所示為蛋白胨（X3）、乙酸鈉（X1）和酵母膏（X2）對L-乳酸產(chǎn)量的影響模型的等高線圖。

圖1 響應(yīng)面分析的等高線圖Fig.1 Response plot

2.2.3 嶺脊分析

運用SAS軟件對回歸模型進行嶺脊分析，尋求最大產(chǎn)乳酸量的穩(wěn)定點及對應(yīng)的因素水平，結(jié)合圖1給出回歸方程的三維響應(yīng)面圖和等高線圖可知，回歸模型存在穩(wěn)定點（－0.047723，0.101134，0.021758），乳酸產(chǎn)量的最大估計值為11.3473g/L。即各因素的真實值分別為：乙酸鈉1.69 g/L、酵母膏6.63 g/L、蛋白胨6.33 g/L，該模型預(yù)測的最大乳酸產(chǎn)量為11.3473 g/L。通過SAS軟件的分析，當(dāng)乙酸鈉1.69 g/L、酵母膏6.63 g/L、蛋白胨6.33 g/L時，回歸模型存在穩(wěn)定點，且為最大值，預(yù)測最大L-乳酸產(chǎn)量為11.3473 g/L。

2.2.4 模型驗證

由于實驗方案中沒有最適配方這個組合，需要對最適培養(yǎng)基進行驗證實驗。驗證實驗結(jié)果表明，其產(chǎn)乳酸量為12.533 g/L，與模型預(yù)測相符，可見模型可較好的預(yù)測實際發(fā)酵情況。從而，確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：乙酸鈉 1.69 g/L、酵母膏 6.63 g/L、蛋白胨 6.33 g/L。比最初的產(chǎn)量7.2 g/L提高了74.07%，表明該模型是合適有效的，并具有一定的實踐指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

通過SAS軟件優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，通過Plackett-Burman實驗得出乙酸鈉、酵母膏、蛋白胨為影響乳酸產(chǎn)量的顯著因素；再經(jīng)過響應(yīng)面分析實驗得出最優(yōu)培養(yǎng)基配方：乙酸鈉1.69 g/L、酵母膏6.63 g/L、蛋白胨6.33g/L，使L-乳酸產(chǎn)量在55℃條件下由初始發(fā)酵條件下的7.2 g/L提高到12.533 g/L，提高百分比為74.07%，優(yōu)化結(jié)果非常顯著。

[1]ABDULLATIF T,Shang-tian Yang.Production of L-lactic acid from Glucose and Starch by Immobilized Cells of rhizopus oryzac in a rotating fibrous bed bioreactou[J].Biotechnology and bioengineering,2002,80(10):1-12

[2]徐忠,汪群慧,姜兆華.L-乳酸的制備及其應(yīng)用的研究進展[J].化學(xué)與粘合,2004,214(4):214-217

[3]疏秀林,施慶珊,馮靜,等.γ-聚谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基的Plackett-Burman法優(yōu)化[J].生物技術(shù)通報,2007(4):173-177

[4]Barry D Greig,Gerald A Payne.Epimerization of lactose to free lactulose in heated modes milk solutions[J].Journal of dairy research,1985,52(3):409-417